槲皮素通過PI3K/AKT信號通路抑制奧沙利鉑耐藥胃癌細胞遷移

池 周,張 豪,蔡玉節,徐志娜

0 引言

2020年,我國胃癌新發及死亡病例數約為48萬例、37萬例,分別占全球的43.94%、48.62%[1-2]。奧沙利鉑作為胃癌化療的一線用藥,其耐藥可影響化療效果,是胃癌化療失敗的重要原因[3-4]。因此,對于進展期患者,逆轉奧沙利鉑耐藥是目前胃癌治療中亟須解決的問題。中醫藥在輔助胃癌患者化療過程中發揮重要作用[5-6]。槲皮素(Quercetin)存在于100多種抗腫瘤中草藥(包括半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草等)中[7-8],其在胃癌治療過程中的作用逐漸受到重視[9-10]。本文通過體外培養胃癌SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞,研究槲皮素對SGC-7901/L-OHP細胞遷移的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購自美國Hyclone公司;槲皮素(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所;IGF-1(PI3K激活劑)購自美國CST公司;RPMI-1640液體培養基購自美國GIBCO公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁生物;4%多聚甲醛購自上海博谷生物科技有限公司;胰蛋白酶和結晶紫染色液購自上海碧云天科技有限公司;Matrigel基質膠(354234)購自美國BD公司;MMP2抗體(40994S)、MMP9抗體(13667S)和GAPDH 抗體(2118)購自美國CST公司;p-PI3K抗體(AF3241)、p-AKT抗體(AF0016)購自Affinity公司;HRP標記山羊抗兔IgG(A0208)和HRP標記山羊抗小鼠IgG(A0216)購自上海碧云天科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和培養環境 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞以含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養基培養,置于細胞培養箱中(飽和濕度、37 ℃、5%CO2)。

1.2.2 CCK-8測定不同濃度槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞增殖抑制率 取對數生長期的SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞接種于96孔板中,每孔1×104個細胞。設置0、5、10、20、30、40、50、60、70、80 μM槲皮素組,置于細胞培養箱中分別培養24 h和48 h;將96孔板中培養基更換為含10% CCK-8的RPMI-1640培養基,培養2 h后測定吸光度。

1.2.3 Transwell測定槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞遷移的作用 分別用不含槲皮素和含槲皮素低、高劑量(10、20 μM)的培養基,將不含血清的SGC-7901/L-OHP細胞加入Transwell上室;并在下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,培養24 h后取出小室,并用棉簽拭去上層未遷移細胞后,加入多聚甲醛固定并用結晶紫染色。

1.2.4 劃痕實驗測定槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞遷移的作用 將SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞種于6孔板,待細胞融合達95%以上,用移液槍頭劃細胞單層形成劃痕,并洗去劃掉的細胞碎片后,用不含血清RPMI-1640培養,分別在0 h和24 h時間點進行拍照記錄。

1.2.5 蛋白印跡法測定p-PI3K、p-AKT、MMP2和MMP9蛋白表達 按“1.2.3”分組處理后,按照文獻方法[11]進行蛋白印跡法,抗體配比:p-PI3K(1∶500)、p-AKT(1∶500)、MMP2(1∶1 000)、MMP9(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

1.2.6 IGF-1和槲皮素共處理SGC-7901/L-OHP細胞 分別設置空白組、槲皮素(10 μM)組、IGF-1 (10 μM)與槲皮素共處理組,用上述Transwell和劃痕實驗檢測SGC-7901/L-OHP細胞遷移,用蛋白印跡法檢測蛋白表達。

2 結果

2.1 槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果顯示,槲皮素作用24 h對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞的IC10分別為(21.55±2.77)、(22.10±1.49) μM (圖1A),作用48 h對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞的IC10分別為(20.73±1.48)、(19.32±2.29) μM (圖1B),選擇10 μM、20 μM作為觀察槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP遷移的低、高劑量。

圖1 槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞增殖的影響

2.2 檢測SGC-7901/L-OHP細胞遷移能力 劃痕實驗和Transwell實驗顯示,與SGC-7901細胞相比,耐藥細胞SGC-7901/L-OHP的劃痕愈合遷移率更高(60.07%±2.19%vs.32.23%±1.91%),穿過Transwell小室的細胞數(308.330±11.9vs.165.67±19.94)更多,提示耐藥細胞SGC-7901/L-OHP的遷移能力強于敏感細胞SGC-7901。見圖2。

圖2 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞遷移能力

2.3 槲皮素對SGC-7901/L-OHP細胞遷移的影響 細胞劃痕后,分別用完全培養基和槲皮素低、高劑量(10、20 μM)培養。培養24 h后,3組的遷移率分別為44.97%±3.19%、34.86%±2.55%、25.16%±3.38%,差異有統計學意義(P<0.05);槲皮素作用SGC-7901/L-OHP細胞24 h后,對照組以及低、高劑量組中穿過Transwell小室的細胞數分別為(555±14)、(349±10)、(177±16)個,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP細胞遷移

2.4 SGC-7901/L-OHP細胞PI3K/AKT信號通路激活 與SGC-7901敏感細胞相比,耐藥細胞SGC-7901/L-OHP的p-PI3K(1.84±0.11vs.1)和p-AKT(2.04±0.10vs.1)及下游的基質金屬蛋白酶MMP2(2.32±0.15vs.1)和MMP9(1.92±0.05vs.1)蛋白表達量顯著升高(P<0.05),而PI3K(1.03±0.05vs.1)和AKT(0.98±0.01vs.1)的蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

圖4 SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9蛋白表達

2.5 槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP細胞PI3K/AKT信號通路 Western blot結果顯示,與對照組相比,槲皮素低/高劑量組p-PI3K(0.68±0.09、0.25±0.05)、p-AKT(0.64±0.03、0.16±0.03)、MMP2(0.76±0.04、0.55±0.02)和MMP9(0.84±0.02、0.70±0.01)的蛋白表達均下降(P<0.05)。見圖5。

圖5 槲皮素對SGC-7901/L-OHP細胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、MMP2、MMP9蛋白表達的作用

2.6 槲皮素通過PI3K/AKT信號通路抑制SGC-7901/L-OHP細胞的遷移 給予PI3K激活劑IGF-1后,再給予槲皮素(10 μM),與未給予IGF-1的SGC-7901/L-OHP細胞相比,劃痕愈合遷移率更大(68.50%±1.79%vs.46.17%±2.68%),穿過Transwell小室的細胞數更多(559.67±18.87vs.369.33±17.25,P<0.05)。見圖6A。與未給予IGF-1的SGC-7901/L-OHP細胞相比,IGF-1與槲皮素共處理組的p-PI3K(0.98±0.01vs.0.82±0.06)、p-AKT(0.96±0.02vs.0.41±0.02)、MMP2(0.98±0.01vs.0.60±0.04)和MMP9(0.99±0.01vs.0.77±0.07)蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖6B。

圖6 IGF-1與槲皮素共處理對SGC-7901/L-OHP細胞遷移和蛋白表達的影響

3 討論

除手術切除外,化療是胃癌最重要的治療手段,可在手術前、中、后進行。晚期胃癌或其他原因不能手術者也可做化療,但胃癌的化療耐藥是治療失敗的主要原因之一[12]。化療的主要目的是抑制癌細胞擴散和殺傷殘存癌細胞,因此,其化療耐藥的表現之一是胃癌細胞更容易遷移而發生遠處轉移。本研究顯示,胃癌耐藥細胞(SGC-7901/L-OHP)的遷移能力高于敏感細胞(SGC-7901)。細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)降解是腫瘤發生遠處轉移的重要步驟,癌細胞只有降解ECM并進入血液循環,才能轉移到全身各處[13]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM最重要的蛋白水解酶,其中MMP2和MMP9在胃癌組織中陽性表達率高于癌旁組織,而且MMP9會隨著胃癌浸潤深度增加而出現高表達[14-16]。本研究中,胃癌耐藥細胞(SGC-7901/L-OHP)的MMP2和MMP9蛋白表達高于敏感SGC-7901細胞。

PI3K/AKT信號通路在胃癌的發病機制中較為重要,可抑制腫瘤細胞凋亡、促進增殖、血管新生及遠處轉移等[17]。研究表明,PI3K/AKT通路異常激活是胃癌化療耐藥的重要原因[18]。本研究顯示,SGC-7901/L-OHP的p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯高于SGC-7901,也間接證實這一研究結果。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物,具有廣泛的藥理學作用,包括抗炎、抗癌、抗氧化及清除自由基等作用[19-20],其對包括胃癌在內的多種腫瘤有抑制作用[10],其聯合化療能抑制胃癌細胞的增生,促進凋亡[9,21-22]。本研究分析槲皮素對SGC-7901和SGC-7901/L-OHP細胞增殖的影響,確定IC10值,排除槲皮素對SGC-7901/L-OHP增殖的影響,確定10 μM、20 μM作為槲皮素測定SGC-7901/L-OHP細胞遷移的實驗劑量,結果顯示,槲皮素在體外能抑制SGC-7901/L-OHP細胞的遷移能力。

槲皮素處理SGC-7901/L-OHP細胞后,Western blot結果顯示,槲皮素能夠抑制MMP2和MMP9蛋白表達,表明槲皮素可能通過抑制ECM降解過程抑制胃癌耐藥細胞遷移,其機制可能是抑制上游p-PI3K、p-AKT的表達。因此,槲皮素可能通過調控PI3K/AKT通路抑制SGC-7901/L-OHP細胞的遷移。為進一步驗證假設,本研究采用PI3K激活劑IGF-1與槲皮素聯合處理SGC-7901/L-OHP細胞,結果顯示,其能降低槲皮素抑制SGC-7901/L-OHP細胞遷移的作用,并拮抗槲皮素誘導的p-PI3K、p-AKT、MMP2和MMP9表達下降能力,提示槲皮素是通過調控PI3K/AKT通路抑制SGC-7901/L-OHP細胞遷移。

綜上,本研究表明,槲皮素能夠在體外抑制SGC-7901/L-OHP細胞的遷移能力,其機制可能是通過調控PI3K/AKT信號通路抑制ECM的降解過程而實現的。此外,本研究僅通過體外細胞實驗驗證,其在體內抑制胃癌耐藥細胞轉移的效果和機制有待進一步探索。