三七白及粉對大鼠腦出血致應(yīng)激性潰瘍的治療作用及其機(jī)制研究※

安 凱 郭沛然 孫玉鳳

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)二科,河北 石家莊 050030;2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,河北 石家莊 050011;3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科,河北 石家莊 050061)

應(yīng)激性潰瘍(stress ulcer,SU)是指機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生的急性胃腸道黏膜糜爛、潰瘍等病變,嚴(yán)重者可并發(fā)消化道出血甚至穿孔,可使原有疾病的程度加重及惡化,增加病死率[1]。預(yù)防SU是救治危重癥患者不可忽視的環(huán)節(jié)[2]。SU是腦出血的主要并發(fā)癥之一,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載,顱腦出血后SU發(fā)生率高達(dá)16%～47%[3]。研究證實(shí),三七、白及可直接作用于消化道出血部位,加速血液凝固,收斂出血部位的創(chuàng)面,消除炎癥、水腫,加快出血傷口愈合[4]。本實(shí)驗(yàn)研究通過觀察三七白及粉對腦出血致SU大鼠的治療作用,并探討其可能作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量(200±5)g,8～10周齡,來源于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心。動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20～25 ℃,相對濕度40%～65%,光照時間12 h/d,循環(huán)通風(fēng)換氣。

1.2 藥物及試劑 三七白及粉混懸液的制備:將三七(廣東一方制藥有限公司,批號:ZZS0020)、白及(廣東一方制藥有限公司,批號:ZZB0110)顆粒劑按照1∶1比例調(diào)勻。根據(jù)臨床70 kg體質(zhì)量人的用藥量換算給藥用量,根據(jù)動物體表面積比率折算等效藥量,溶入0.9%氯化鈉注射液制備相應(yīng)濃度混懸液,并折算出給藥劑量(2.5 g/kg),給藥容積為1 mL/100 g。試劑:前列腺素E2(PGE2)試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,批號:20170621);丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20161103);一氧化氮(NO)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20170528);超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司,批號:20170715)。

1.3 儀器 雙目光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司),TGL-16G-A型低溫高速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠),DK-600A型電熱恒溫水箱(上海一恒科技有限公司),MDF-382E型超低溫冰箱(日本三洋公司),HM-200電子天平(日本三洋公司),WH-43電熱恒溫干燥箱(天津泰斯特儀器公司),YXQG02型電熱式蒸氣消毒器(山東新華醫(yī)療器械廠),UV755B型紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及動物模型制備 將大鼠隨機(jī)分為3組:對照組、模型組、三七白及粉組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,模型組、三七白及粉組采用自體血定位注射法建立大鼠基底節(jié)腦出血致SU模型。以10%水合氯醛將模型組、三七白及粉組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。待麻醉成功后,將大鼠俯臥位固定,頭頂部脫毛處理,放置于大鼠腦立體定位儀下。用碘酒消毒頭頂脫毛部,以酒精脫碘后。將頭頂部鋪孔巾以暴露術(shù)野,沿頂正中線右側(cè)0.5 cm眼耳連線間將皮膚切開1 cm,將顱骨皮下筋膜鈍性分離。定位(前囟前0.2 mm,正中旁開3.0 mm)后以顱鉆打孔,直徑為1 mm。于大鼠尾靜脈處抽取自體血200 μL,抽取后立即從顱頂鉆孔處垂直進(jìn)針約6 mm,于右腦基底節(jié)區(qū)處用微量泵泵入自體血(5 μL/min)。注射完畢后留針10 min后緩慢出針5 min。縫合皮膚切口,于切口處涂抹碘酒消毒后將大鼠置籠內(nèi)觀察。在大鼠腦出血模型制備6 h后,使用Longa評分法[7]進(jìn)行評分:0分,無任何明顯體征;1分,對側(cè)肢體不能完全伸展;2分,對側(cè)肢體癱瘓,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈,有追尾現(xiàn)象;3分,行走時向?qū)?cè)傾倒;4分,有意識障礙。2分以上者認(rèn)為造模成功。死亡和造模不成功者排除。

1.4.2 灌胃給藥 在造模完成后第3天開始灌胃給藥,三七白及粉組予2.5 g/kg的三七白及粉混懸液灌胃,給藥容積為1 mL/100 g。對照組和模型組分別給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃14天。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 血液指標(biāo) 在末次給藥2 h后,經(jīng)大鼠下腔靜脈取血4 mL。其中取1 mL,注入加有0.5 mL消炎痛-EDTA-Nat液的抗凝試管內(nèi),以3000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃保存?zhèn)溆?檢測PGE2。另取血3 mL置于不抗凝試管中,以2500 r/min離心15 min,取上清液,測NO、SOD及MDA。方法按試劑盒說明書操作

1.5.2 組織形態(tài)觀察 ①取腦組織:經(jīng)下腔靜脈取血后,處死大鼠,完整取出大鼠腦組織。②胃組織形態(tài)觀察:胃注入1%甲醛溶液8 mL并結(jié)扎幽門、賁門后提取整個胃組織,浸入1%甲醛溶液中10 min,用手術(shù)剪沿胃大彎切開整胃,隨后展開鋪平,經(jīng)0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后,沿潰瘍周圍切掉胃壁(保留潰瘍邊緣3 mm周圍組織),觀察大體形態(tài)和胃潰瘍條數(shù)。將長軸的中點(diǎn)沿潰瘍中心縱向切取一分為二備用。

1.5.3 病理學(xué)觀察 用中性甲醛固定所取的腦及胃潰瘍組織24 h,脫水后進(jìn)行石蠟包埋、切片并蘇木素-伊紅(HE)染色。HE染色方法:用甲苯-無水酒精脫去石蠟,然后經(jīng)過無水酒精、70%酒精、50%酒精依次過渡到水。后經(jīng)蘇木精液染色5 min,后以蒸餾水流水清洗掉蘇木精液,然后1%鹽酸乙醇溶液分色。后以淡氨水沖洗,再用蒸餾水溫和清洗。1%伊紅染液染色5～10 min比照染色,提取切片,用蒸餾水清洗脫去浮色。后經(jīng)酒精等級脫水,直接用碳酸二甲苯透明,將中性樹膠封片,后鏡檢。

1.5.4 潰瘍指數(shù)測定 按Guth[8]標(biāo)準(zhǔn)計算,潰瘍指數(shù)=每組動物胃黏膜潰瘍長度×寬度的和/每組動物數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn):斑點(diǎn)糜爛記1分;糜爛長度<1 mm記2分;≥1 mm,<2 mm記3分;≥2 mm,<3 mm記4分,依次類推。寬度>2 mm,分值×2。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比較 與對照組比較,模型組大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均降低(P<0.05),MDA升高(P<0.05);與模型組比較,三七白及粉組大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均升高(P<0.05),MDA降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比較

2.2 腦組織病理觀察 大鼠腦組織病理觀察:基底節(jié)區(qū)細(xì)胞排列不規(guī)則,細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則,部分出現(xiàn)核皺縮現(xiàn)象,血腫及周圍神經(jīng)元減少,膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管增生明顯。見圖1。

圖1 大鼠腦組織病理學(xué)圖片(HE染色,×100)

2.3 各組大鼠胃組織形態(tài)觀察 對照組大鼠胃黏膜表面光滑,色淡紅,并覆蓋有大量黏液,黏膜表面及漿膜面完整,未見水腫、充血等病理變化。模型組可見大量散在點(diǎn)、線狀出血或糜爛,并伴有炎性滲出。三七白及粉組大部分可以找到潰瘍灶,但面積較小,部分可見充血點(diǎn)及炎性滲出物。見圖2。

圖2 各組大鼠胃組織形態(tài)

2.4 各組大鼠胃組織病理觀察 對照組胃黏膜組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整;模型組胃黏膜鏡下可見胃黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落,腺體結(jié)構(gòu)破壞,黏膜間質(zhì)明顯充血、水腫和出血;三七白及粉組胃黏膜表面未見糜爛,間質(zhì)充血、水腫程度較模型組明顯減輕。見圖3。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)圖片(HE染色,×40)

2.4 各組大鼠潰瘍指數(shù)比較 三七白及粉組大鼠潰瘍指數(shù)低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠潰瘍指數(shù)比較

3 討論

SU是腦出血最常見的并發(fā)癥之一。其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后是一個非常復(fù)雜的病理生理過程。有研究推測可能腦出血量越大,腦水腫越嚴(yán)重,病變范圍越廣,越容易發(fā)生SU,消化道黏膜血流量減少,缺血缺氧致急性糜爛、潰瘍、出血[5]。

中醫(yī)學(xué)無SU的病名,但是與中風(fēng)、吐血、便血等相對應(yīng)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腦出血所致SU以“顱腦損傷,心神失養(yǎng),脾胃升降失調(diào),氣滯血瘀,郁而化熱,迫血妄行而致出血”為病因病機(jī)。本研究通過制備腦出血致SU模型,并制作腦組織病理切片,發(fā)現(xiàn)腦組織形態(tài)顯著改變。此外,胃潰瘍指數(shù)顯著增加,經(jīng)過對胃組織HE染色后,結(jié)果也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn),從而進(jìn)一步確認(rèn)了模型制備成功。本研究旨在通過對腦出血致SU大鼠進(jìn)行治療干預(yù),以探索有效的治療方法。

在《本草求真》《瀕湖集簡方》《本草新篇》等古籍均有口服三七、白及粉劑治療急性消化道出血性疾病的記載。白及消腫生肌,收斂止血;三七散瘀止血,改善循環(huán)。兩藥聯(lián)用,一散一收,在止血的同時,可以改善創(chuàng)傷臨近組織的微循環(huán),促進(jìn)愈合[6]。有學(xué)者研究結(jié)果表明,三七白及粉類方劑與西藥聯(lián)合治療消化性潰瘍的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用西藥治療[7]。本研究采用三七白及粉干預(yù)腦出血致SU大鼠,結(jié)果顯示,與模型組比較,三七白及粉組能夠明顯降低黏膜潰瘍的發(fā)生,且潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.05)。這說明三七白及粉對腦出血致SU的胃黏膜有治療作用。

消化道出血是腦出血的常見并發(fā)癥之一,因腦血管意外所引起的SU,在臨床表現(xiàn)、治療方法及預(yù)后方面有著不同于其他SU的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要探討三七白及粉促進(jìn)腦出血致SU愈合的可能的作用機(jī)制。SU的發(fā)病機(jī)制涉及血液微循環(huán)不足,隨后導(dǎo)致組織低氧血癥和氧化應(yīng)激,以及氧自由基的積累。氧自由基會破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)(包括DNA 和脂質(zhì))的化學(xué)結(jié)構(gòu),并以多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。機(jī)體通過酶促和非酶促防御機(jī)制來防御氧自由基。非酶防御機(jī)制通過組織病理學(xué)檢查評估,酶防御機(jī)制通過生化檢查評估。NO是血管內(nèi)皮釋放的炎性介質(zhì),抗氧化作用顯著,可保護(hù)胃黏膜[8]。MDA是機(jī)體內(nèi)不飽和脂肪酸在脂質(zhì)過氧化作用下形成的最終產(chǎn)物,可使細(xì)胞變性、壞死[9]。PGE2和 SOD 是對抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)的胃炎的代表性黏液保護(hù)因子。特別是PGE2通過多種機(jī)制在維持胃黏膜完整性中發(fā)揮重要作用[10-11]。有藥物如扎魯司特能通過PGE2和抗炎途徑對吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍起到胃保護(hù)作用[12]。魯斯可皂苷元通過升高PGE2水平對乙酸引起的胃潰瘍發(fā)揮有效的治療作用[13]。本次研究中,三七白及粉組治療后血清MDA水平低于模型組,SOD和NO水平高于模型組,提示三七白及粉能夠有效清除氧自由基,提高多種抗氧化因子活性。類似的研究中,三七皂苷處理晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,MDA的活性降低,SOD活性增加[14]。三七皂苷 R1增加了氧糖剝奪/復(fù)氧后周細(xì)胞SOD表達(dá)[15]。大量文獻(xiàn)報道,PGE2與潰瘍病的發(fā)生關(guān)系密切[16-17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表現(xiàn),與對照組相比較,模型組大鼠PGE2含量明顯降低,說明腦出血致SU模型的形成可能與PGE2含量降低有關(guān)。三七白及粉組PGE2含量高于模型組,提示升高PGE2含量是三七白及粉治療腦出血致SU的一個途徑。三七白及粉通過上調(diào)PGE2、SOD和NO來減少M(fèi)DA的量。提示PGE2減少在SU發(fā)病中有重要意義。而三七白及粉治療潰瘍的機(jī)制可能與升高PGE2有關(guān)。

綜上所述,三七白及粉作為活血化瘀、生肌止痛之良方,對腦出血致SU具有良好的治療作用,而且作用靶點(diǎn)是多方面的。三七白及粉通過顯著提升血清NO含量,以提高胃黏膜血流量,增加黏膜抵抗能力。提高PGE2含量促進(jìn)胃黏膜血流和胃黏液分泌,以增加胃黏膜表面活性物質(zhì),對胃黏膜起到保護(hù)作用。提高血清SOD活性,以改善應(yīng)激狀態(tài)下胃黏膜的血流量,阻止有害游離基的形成,保護(hù)胃黏膜,同時降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平,促進(jìn)潰瘍愈合。