食管癌多倍體腫瘤巨細(xì)胞DNA定量分析

張國棟,任旖琳,王 衛(wèi)

食管癌是全球第六大常見的癌癥死亡原因,患者預(yù)后較差,5年生存率僅為15%～25%[1]。近年來,多倍體腫瘤巨細(xì)胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)在惡性腫瘤研究中被重新重視,病理醫(yī)師在日常工作中常發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中含有單個(gè)巨大的細(xì)胞核或多個(gè)細(xì)胞核的瘤巨細(xì)胞。Fei等[2]將細(xì)胞核體積與二倍體腫瘤細(xì)胞核的比例≥3的癌細(xì)胞定義為PGCCs。PGCCs促進(jìn)實(shí)體腫瘤的異質(zhì)性,具有腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)的特征[3]。PGCCs的數(shù)量通常隨著病理分級和分期程度的增高而增加[3-5]。CSCs具有自我更新和多能分化的能力,以促進(jìn)癌癥進(jìn)展和化療耐藥[6]。CD133是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)CSCs的標(biāo)志物[7],ESCC中CD133的中位陽性率為31.9%(21%～44.2%),CD133+ESCC患者的5年總生存率僅為1.27%(0.93%～1.73%)[8]。CD133+腫瘤細(xì)胞和PGCCs均與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān),目前有關(guān)CD133+腫瘤細(xì)胞與PGCCs關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道較少,因此本文將重點(diǎn)分析CD133+CSCs與PGCCs DNA含量之間的關(guān)系,探究定義PGCCs DNA含量的閾值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人ESCC細(xì)胞系TE-1和KYSE-150購自德國生物材料資源中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)。細(xì)胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 PGCCs誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞置于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí),加入300 nmol/L紫杉醇(M1970,Abmole公司)培養(yǎng)24 h,然后撤銷紫杉醇,更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至第9天獲得TE-1-PGCCs。

1.3 細(xì)胞塊制作TE-1對照細(xì)胞和紫杉醇處理細(xì)胞分別消化,離心富集,在10%中性福爾馬林中固定12 h。按照細(xì)胞塊制備試劑盒(凈優(yōu),北京賽普九洲公司)說明書制作細(xì)胞塊,后經(jīng)脫水、浸蠟、包埋制作成石蠟細(xì)胞塊。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色將制成的石蠟細(xì)胞塊4 μm厚切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,EDTA高溫抗原修復(fù),隨后按照通用兩步法檢測試劑盒(小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測系統(tǒng))(貨號PV-9000,北京中杉金橋公司)實(shí)驗(yàn)步驟操作:內(nèi)源性過氧化物酶阻斷,一抗CD133(稀釋比1 ∶100)、CD44(稀釋比1 ∶100)和c-Myc(稀釋比1 ∶100)4 ℃孵育過夜(均購自Proteintech公司),滴加反應(yīng)增強(qiáng)劑,滴加HRP標(biāo)記的抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育1 h,DAB染色。

1.5 磁珠分選CD133+腫瘤細(xì)胞分別計(jì)數(shù)2×107個(gè)TE-1和KYSE-150細(xì)胞與CD133微珠(貨號130-097-049,Miltenyi公司)4 ℃孵育15 min,離心后棄上清液。細(xì)胞和磁珠被重懸并轉(zhuǎn)移至分離柱(貨號130-042-201,Miltenyi公司),安裝在MACS分離器上(miniMACS,貨號130-042-102)。用普通緩沖液洗滌獲得CD133-細(xì)胞(未結(jié)合磁珠),用洗脫緩沖液洗滌獲得CD133+細(xì)胞(結(jié)合磁珠)。

1.6 細(xì)胞DNA定量分析分選獲得的TE-1-CD133+、TE-1-CD133-、KYSE-150-CD133+、KYSE-150-CD133-細(xì)胞采用Liquid-Prep液基(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷公司)方法固定,滴片制成薄片,行Feulgen染色。所有Feulgen染色片用MotiCytometer全自動(dòng)細(xì)胞DNA定量圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描處理。定義掃描細(xì)胞數(shù)量為25 000,以標(biāo)本中二倍體細(xì)胞作為內(nèi)參照,并根據(jù)100多個(gè)參數(shù)特征值對被測細(xì)胞核進(jìn)行自動(dòng)分類和計(jì)數(shù),其中DNA指數(shù)(DNA Index, DI)為關(guān)鍵參數(shù),可表示DNA含量。DI計(jì)算方法:被測細(xì)胞的積分光密度(IOD)與二倍體細(xì)胞IOD的比值。如為二倍體細(xì)胞(N,染色體組的數(shù)量,作為單倍體基因組的倍數(shù):1N是單倍體的精子或卵細(xì)胞染色體含量,2N是二倍體細(xì)胞的染色體含量),DI值為1±0.25;當(dāng)1.25

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間差異采用T檢驗(yàn)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生PGCCs驗(yàn)證采用紫杉醇處理TE-1細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的TE-1-PGCCs經(jīng)HE染色顯示,PGCCs細(xì)胞體積明顯大于對照組細(xì)胞(圖1A);DNA定量分析顯示,與對照組細(xì)胞相比,紫杉醇處理的細(xì)胞中≥5N亞群的比例顯著增加,而≤2N和2N～4N細(xì)胞亞群的比例顯著降低(P<0.000 1,圖1B);進(jìn)一步觀察DI分布發(fā)現(xiàn),紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞在DI≥4(≥8N)細(xì)胞亞群中顯著富集,對照組細(xì)胞也有少量≥8N細(xì)胞(圖1C),表明普通培養(yǎng)細(xì)胞中也存在一定數(shù)量的≥8N腫瘤細(xì)胞,這提示定義PGCCs DNA含量的最小數(shù)值可能是8N。

圖1 紫杉醇誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生PGCCs驗(yàn)證:A.HE染色顯示TE-1-DMSO細(xì)胞和紫杉醇誘導(dǎo)的TE-1-PGCCs體積大小;B.細(xì)胞DNA定量分析每個(gè)亞群中的細(xì)胞比例;C.細(xì)胞DNA定量分析不同DI細(xì)胞亞群的分布,每個(gè)“+”代表1個(gè)細(xì)胞;***P<0.000 1

2.2 PGCCs中CD133、CD44、c-Myc蛋白的表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測CSCs標(biāo)志物CD133、CD44和c-Myc蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:TE-1-PGCCs高表達(dá)CD133,對照細(xì)胞弱表達(dá)CD133;部分TE-1-PGCCs高表達(dá)CD44和c-Myc,對照細(xì)胞則不表達(dá)CD44和c-Myc(圖2)。上述結(jié)果提示紫杉醇誘導(dǎo)的PGCCS高表達(dá)CSCs標(biāo)志物,尤其是CD133。

DMSO紫杉醇CD133CD44c-Myc

2.3 CD133+和CD133-亞群細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征將采用CD133磁珠分選獲得的TE-1-CD133+細(xì)胞和TE-1-CD133-細(xì)胞分別行Feulgen染色,結(jié)果顯示:與TE-1-CD133-組相比,PGCCs主要富集于TE-1-CD133+組(圖3A)。CD133-細(xì)胞的有絲分裂相明顯多于CD133+細(xì)胞(P<0.000 1,圖3B、C),說明CD133-細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于CD133+細(xì)胞。與CD133-細(xì)胞相比,CD133+細(xì)胞含有更多的(直徑<20)小核或大核(直徑>30 μm)細(xì)胞,而中等大小核(直徑20～30 μm)細(xì)胞數(shù)量顯著低于CD133-組(圖3D)。

圖3 CD133-和CD133+食管癌的細(xì)胞特征:A.低倍視野廣泛分布PGCCs(500 μm);B.高倍視野有絲分裂細(xì)胞(黑箭頭),紅箭頭示PGCCs(50 μm);C.低倍視野下細(xì)胞有絲分裂相數(shù)量(5個(gè)隨機(jī)視野),***P<0.000 1;D.低倍視野中不同核直徑細(xì)胞的比例(5個(gè)隨機(jī)視野),***P<0.000 1

2.4 CD133+和CD133-亞群細(xì)胞DNA含量特征細(xì)胞DNA定量分析顯示,TE-1-CD133+和KYSE-150-CD133+中富集了DI≥4(≥8N)的PGCCs,而TE-1-CD133-和KYSE-150-CD133-細(xì)胞中幾乎不存在這種多倍體細(xì)胞(圖4)。本組結(jié)果提示,在ESCC中PGCCs(特別是≥8N的PGCCs)是CSCs的一個(gè)特殊亞群。

圖4 細(xì)胞DNA定量分析:A.TE-1-CD133-和TE-1-CD133+細(xì)胞亞群的DNA定量分析;B.KYSE-150-CD133-和KYSE-150-CD133+細(xì)胞亞群的DNA定量分析;DI=1(2N)為二倍體,DI=2(4N)為四倍體,DI=4(8N)為八倍體

3 討論

細(xì)胞多倍體化是由發(fā)育程序或應(yīng)激誘導(dǎo)的,產(chǎn)生于細(xì)胞融合或細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程,內(nèi)復(fù)制過程是細(xì)胞完成DNA復(fù)制后,不能完成胞質(zhì)分裂或完全不進(jìn)入M期[9]。多倍體現(xiàn)象在人類癌癥中較常見,PGCCs在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn),數(shù)量相對較少(5%～20%)[10]。在約37%的人類腫瘤中觀察到PGCCs,在化、放療和CoCl2模擬低氧環(huán)境下,PGCCs的數(shù)量可能顯著增加。在癌癥治療中,大多數(shù)基因毒性藥物可導(dǎo)致基因組休克和細(xì)胞體積增大,從而導(dǎo)致基因組復(fù)制和PGCCs形成。雖然PGCCs長期被忽略,但最近其被認(rèn)為是引發(fā)癌癥、耐藥和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?PGCCs中核異型性的產(chǎn)生也是病理診斷中最重要的癌癥標(biāo)志[11]。PGCCs基因組拷貝數(shù)增加,更適應(yīng)缺氧微環(huán)境和各類應(yīng)激,并通過無絲分裂更高效地產(chǎn)生子代細(xì)胞,這些機(jī)制可以共同工作,促進(jìn)腫瘤快速惡性生長[12]。

PGCCs表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物,如胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、NANOG、SOX2和YAP及某些CSCs標(biāo)志物CD133、CD44等[3-4, 12-13],PGCCs與人類胚胎發(fā)生于早期的卵裂球高度相似,如果把腫瘤起源的第二條途徑(PGCCs途徑)與人類生命周期聯(lián)系起來,可將體細(xì)胞去分化經(jīng)PGCCs形成的未分化腫瘤稱為卵裂球樣(性)腫瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),紫杉醇誘導(dǎo)的TE-1-PGCCs高表達(dá)CSCs標(biāo)志物CD133。未經(jīng)紫杉醇處理的TE-1細(xì)胞中也含有少量的PGCCs,這部分PGCCs主要富集在CD133+細(xì)胞亞群,進(jìn)一步對CD133+細(xì)胞進(jìn)行DNA定量分析,發(fā)現(xiàn)八倍體(8N,相當(dāng)于4個(gè)正常細(xì)胞核)及以上PGCCs幾乎完全富集在CD133+細(xì)胞亞群,提示≥8N的PGCCs是CSCs。

在另一項(xiàng)研究中,作者也發(fā)現(xiàn)PGCCs主要分布在鼻咽癌細(xì)胞CNE2-CD133+亞群,且分散在小細(xì)胞中,而CD133-細(xì)胞大小較為均一[14],本組在食管癌中觀察到的結(jié)果與之一致,提示這是在腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象。PGCCs通過兩種不對稱分裂(非有絲分裂)方式產(chǎn)生子細(xì)胞:出芽和破裂,可以單獨(dú)或一起發(fā)生,隨后產(chǎn)生大量小體積的子代細(xì)胞[4]。卵巢癌HEY細(xì)胞的研究顯示,腫瘤出芽中的HEY-PGCCs高表達(dá)CD133和CD44,表明這些出芽的細(xì)胞具有CSCs樣特性[4],由于子細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)超PGCCs,這可能解釋了CSCs的體積可以很小(子代細(xì)胞)或很大(PGCCs),但以小體積細(xì)胞為主。

Feulgen染色是一種DNA定量染色方法,染色強(qiáng)度與DNA濃度呈正比,通過測定染色細(xì)胞核的IOD來計(jì)算細(xì)胞核DNA含量,用DI來表示DNA含量。細(xì)胞DNA定量分析采用全自動(dòng)數(shù)字掃描結(jié)合AI細(xì)胞識別和深度學(xué)習(xí)算法對細(xì)胞核中的DNA含量或染色體倍數(shù)進(jìn)行定量檢測和分析,來判斷是否存在癌變或癌前病變的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)為腫瘤的惡性程度提供參考依據(jù)。細(xì)胞DNA定量分析作為一種成熟的病理技術(shù),已廣泛用于子宮頸脫落細(xì)胞的輔助診斷[15]。然而,當(dāng)前仍主要通過細(xì)胞/細(xì)胞核等形態(tài)特征定義PGCCs。

綜上,本實(shí)驗(yàn)通過分析食管癌細(xì)胞DNA含量、CSCs和PGCCs三者之間的關(guān)系,首次發(fā)現(xiàn)八倍體及以上的PGCCs是一類CD133+CSCs。這一發(fā)現(xiàn)可能為定義PGCCs提供了一個(gè)DNA含量的參考,也為開發(fā)靶向PGCCs治療腫瘤提供新思路。