結(jié)直腸癌中GIPC2表達(dá)及臨床病理意義

劉雅新,閆文卿,馬怡君,韓 微,周彩婷,吳 艷,嚴(yán)雪冰,徐 健,王 磊

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第3位,病死率位居第5位[1],早期因無明顯癥狀易被忽視[2]。目前臨床多采用腸鏡、影像學(xué)檢查、病理活檢等方式綜合診斷,術(shù)后主要依據(jù)TNM分期進(jìn)行預(yù)后評(píng)判,目前仍缺乏更為有效的早期診斷和預(yù)后評(píng)判標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明GIPC2在多種腫瘤中的表達(dá)發(fā)生變化,如在胃癌中表達(dá)上調(diào),在腎癌和腎上腺皮質(zhì)癌中表達(dá)下調(diào)[3]。GIPC2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)尚無相關(guān)報(bào)道。本組前期在以m6A甲基化修飾和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)構(gòu)建的結(jié)直腸癌多基因模型分析中發(fā)現(xiàn),GIPC2表達(dá)發(fā)生顯著改變[4]。現(xiàn)通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索并預(yù)測(cè)GIPC2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況;采用免疫組化法檢測(cè)GIPC2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá),分析其與臨床病理特征、患者預(yù)后之間的關(guān)系,以探討GIPC2在結(jié)直腸癌診療和預(yù)后評(píng)判中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2021～2022年揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者95例,所有病例均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診,且均為結(jié)直腸原發(fā)病例,患者術(shù)前未行其他相關(guān)治療,臨床資料均完整。回顧性分析其臨床資料并通過電話隨訪,將臨床病理特征分組:年齡、性別、大體類型、腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期。其中,≤60歲21例,>60歲74例;男性54例,女性41例;腫瘤最大徑≤5 cm的62例,>5 cm的33例;大體類型中,隆起型36例,潰瘍型59例,無彌漫型;高分化4例,中分化70例,低分化21例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例,無淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移57例;Ⅰ期12例,Ⅱ期44例,Ⅲ期36例,Ⅳ期3例。

1.2 方法免疫組化檢測(cè)采用手工SP染色法:73 ℃烤片箱烤片后,脫蠟脫水,于高壓鍋中以pH 6.0的檸檬酸鹽修復(fù)液煮沸后晾涼;再加入適量?jī)?nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫10 min后PBS洗凈;加入適量GIPC2(上海雅吉生物公司)過夜后用PBS沖洗,再加入適量二抗37 ℃孵育30 min;加入DAB顯色后用水沖洗,蘇木精染色,分化、沖洗反藍(lán)、脫水透明,封固[5]。

1.3 結(jié)果判定免疫組化染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)判定:(1)按染色強(qiáng)度評(píng)分:無陽性著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞百分比評(píng)分:≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,≥76%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘:0～7分為低表達(dá),8～12分為高表達(dá)[6]。依據(jù)抗體使用說明,GIPC2陽性定位于細(xì)胞質(zhì)。

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析GEPIA是以癌癥基因組圖譜TCGA和基因型-組織表達(dá)GTEx數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的應(yīng)用程序[7]。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析GIPC2在不同腫瘤和其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)差異,及其與結(jié)直腸癌患者TNM分期和預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率(%)描述,組間差異采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn),評(píng)估GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。以上均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)直腸癌中GIPC2表達(dá)在m6A甲基化修飾及EMT構(gòu)建的結(jié)直腸癌多基因模型的生信分析中,篩選EMT基因進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,應(yīng)用Cox分析篩選出與m6A相關(guān)的模塊基因,通過分析風(fēng)險(xiǎn)比及預(yù)后顯著性,得到特征基因合計(jì)9個(gè),其中GIPC2:HR=1.57,P<0.001,提示GIPC2與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān);GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示,GIPC2在多種腫瘤中的表達(dá)發(fā)生變化,其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常腸組織(圖1A);生存預(yù)測(cè)顯示,低表達(dá)GIPC2的患者生存率更低(圖1B);GIPC2與結(jié)直腸癌的TNM分期密切相關(guān)(圖1C)(P<0.01)。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析:A.GIPC2在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常腸組織中的表達(dá);B.GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系;C.GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期的關(guān)系

2.2 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常腸組織中GIPC2的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,GIPC2表達(dá)定位于腺上皮胞質(zhì)(圖2)。95例結(jié)直腸癌中GIPC2高表達(dá)40例(42.1%)(圖2A),低表達(dá)55例(57.9%)(圖2B);對(duì)應(yīng)癌旁正常腸組織中GIPC2高表達(dá)82例(86.3%)(圖2C),低表達(dá)13例(13.7%)(圖2D)。與癌旁正常腸組織相比,結(jié)直腸癌組織中GIPC2多呈低表達(dá),兩組相比差異有顯著性(P<0.001)。

ABCD

2.3 GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示,GIPC2表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大體類型和腫瘤最大徑無關(guān)(P均>0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期相關(guān)(P均<0.05,表1)。

表1 GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系95例結(jié)直腸癌患者中19例失訪。生存分析結(jié)果顯示,低表達(dá)GIPC2結(jié)直腸癌患者的2年生存率(47.3%)明顯低于高表達(dá)GIPC2患者(72.5%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖3 Kaplan-Meier法分析GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌來源于結(jié)直腸黏膜上皮,常由基因突變引起,基因異常表達(dá)可影響結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物現(xiàn)以CEA、CK20、Villin、CDX-2、HER2等為主,對(duì)診斷、治療和預(yù)后具有一定的意義[9]。因結(jié)直腸癌早期缺乏特異性體征,中晚期病變深入盆腔,導(dǎo)致患者預(yù)后不良[10]。因此,尋找有效的早期診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)成為臨床研究的熱點(diǎn)。

GIPC基因由GH1、GH2和PDZ三個(gè)結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成[11]。GIPC2(GIPC PDZ domain containing family member 2)與GIPC1和GIPC3共同構(gòu)成GIPC家族,具有進(jìn)化的保守性和功能的相似性。GIPC1可與多種蛋白相互作用,參與跨膜分化程度和TNM分期的組間比較采用Fisher確切概率法,其余采用χ2檢驗(yàn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控信號(hào)通路等[12]。有報(bào)道稱,GIPC2是一種內(nèi)分泌特異性腫瘤抑制基因,在嗜鉻細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào),激活p27的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[13]。此外GIPC2在急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)下調(diào),在雌激素誘導(dǎo)的乳腺腫瘤中表達(dá)上調(diào);GIPC2的體細(xì)胞突變發(fā)生于黑色素瘤和卵巢癌中;GIPC2的高甲基化和低表達(dá)則導(dǎo)致乳頭狀腎細(xì)胞癌患者的存活率低[14]。最新研究表明m6A甲基化修飾通過多種途徑參與調(diào)控結(jié)直腸癌的分化增殖過程,其主要轉(zhuǎn)錄因子Snail、ZEB1/2和Twist1/2可能發(fā)揮重要作用[15]。有研究證實(shí)EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的總生存率有關(guān)[16]。還有研究指出,在結(jié)直腸癌組織中GIPC2 mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)[17]。截至目前,GIPC2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義尚未見詳細(xì)報(bào)道。

基于m6A甲基化修飾和EMT構(gòu)建結(jié)直腸癌多基因預(yù)后模型的研究結(jié)果提示,GIPC2表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展可能密切相關(guān)[4]。GEPIA數(shù)據(jù)庫的檢索也預(yù)測(cè)了結(jié)直腸癌中GIPC2的表達(dá)低于癌旁正常腸組織。本組免疫組化染色顯示,GIPC2表達(dá)于腺上皮胞質(zhì),在正常腸組織中呈高表達(dá),在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá);GIPC2在結(jié)直腸癌中的陽性率明顯降低(P<0.05)。GIPC2表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05),這些結(jié)果均提示了GIPC2參與腫瘤侵襲和發(fā)展的過程,并且其表達(dá)水平越低,腫瘤分化越差。生存分析表明,低表達(dá)GIPC2患者較高表達(dá)患者的生存率更低(47.3%vs72.5%,P<0.05),推測(cè)GIPC2的下調(diào)很可能導(dǎo)致患者不良預(yù)后,其可以作為評(píng)估患者預(yù)后的指標(biāo)。臨床可通過免疫組化檢測(cè)GIPC2表達(dá)為結(jié)直腸癌患者的臨床治療和預(yù)后評(píng)判提供一定的參考。

綜上,GIPC2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移,影響患者預(yù)后,未來有可能作為新的結(jié)直腸癌臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的可靠指標(biāo)。后續(xù)我們將擴(kuò)大樣本量并改進(jìn)免疫組化手工染色方法,進(jìn)一步探討GIPC2在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。