結(jié)直腸癌中FOXA3的表達(dá)及其臨床意義

陳宇晶,汪靜宇,張 琳,王 振

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤[1-3],其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近期研究發(fā)現(xiàn),叉頭框家族蛋白(forkhead box proteins, FOX)亞家族A3(FOXA3)與肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5],但目前有關(guān)FOXA3在結(jié)直腸癌中作用的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)FOXA3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),FOXA3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。結(jié)果提示,FOXA3可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。本文通過(guò)分析結(jié)直腸癌組織中FOXA3的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系,探討FOXA3在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義,旨在為結(jié)直腸癌的機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年12月～2019年1月浙江省嘉興市第一醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織和配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本31對(duì)(其中男性17例,女性14例)進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測(cè)。所有標(biāo)本術(shù)后立即放入液氮中冷凍,然后保存于-80 ℃冰箱,直至RNA被提取。另收集2009年1月～2010年12月嘉興市第一醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織120例(其中男性69例,女性51例)進(jìn)行免疫組化檢測(cè),標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋。所有患者術(shù)前均未行化療或放療等治療。結(jié)直腸癌病理診斷均由兩名病理診斷醫(yī)師獨(dú)立完成。本研究經(jīng)嘉興市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)LS2018-204),患者均知情同意。

1.2 主要試劑組織RNA提取試劑盒(貨號(hào)74106,美國(guó)QIAGEN公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RR037A,大連寶生物公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)RR420A,大連寶生物公司);兔抗人FOXA3多克隆抗體(貨號(hào)Ab238112,稀釋比1 ∶100,美國(guó)Abcam公司);免疫組化檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)K5007,丹麥Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析TCGA數(shù)據(jù)(結(jié)腸癌組織275例,配對(duì)正常組織349例,直腸癌組織92例,配對(duì)正常組織318例)。在Single Gene Analysis模塊中輸入基因名FOXA3,點(diǎn)擊“GoPIA!”,選擇Expression DIY中的Box plot模塊進(jìn)行分析?！癉atasets Selection”框選擇結(jié)腸癌和直腸癌,其他選項(xiàng)為默認(rèn)選項(xiàng),點(diǎn)擊“Plot”分析數(shù)據(jù),下載PDF箱式圖。

1.3.2RT-qPCR 用勻漿機(jī)將組織打碎后,采用組織RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取新鮮結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的RNA,隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存)。用GAPDH基因作為內(nèi)參照,采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)FOXA3基因表達(dá)量。GAPDH和FOXA3引物序列來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI),引物合成由上海生工公司完成。GAPDH引物序列:上游5′-ACCACAGTC CATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為452 bp。FOXA3引物序列:上游5′-GAGATGCCGAAGGGGTATCG-3′,下游5′-ACCTTGACGAAGCAGTCGTT-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為224 bp。RT-qPCR檢測(cè)使用大連寶生物公司的SYBR熒光試劑盒,反應(yīng)體系為10 μL,儀器為Stepone plus熒光定量PCR儀(ABI公司),每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔,統(tǒng)計(jì)平均值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算FOXA3基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。FOXA3表達(dá)定位于細(xì)胞核。評(píng)分根據(jù)DAB顯色結(jié)果,采用免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)(immunoreactive scores, IRS)進(jìn)行評(píng)分,IRS以陽(yáng)性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)表示[6]。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分,10%～50%為2分,51%～80%為3分,>80%為4分。(2)按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)陽(yáng)性著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。IRS<6分為低表達(dá),≥6分為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達(dá)(1)RNA測(cè)序分析:將3對(duì)結(jié)直腸癌組織和配對(duì)癌旁正常組織進(jìn)行FOXA3 mRNA測(cè)序,結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中FOXA3 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(表1)。(2)生物信息學(xué)分析:GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,FOXA3在結(jié)腸癌和直腸癌中的表達(dá)均高于癌旁正常組織(圖1)。(3)PCR驗(yàn)證:RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,31例結(jié)直腸癌組織中FOXA3 mRNA表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(t=2.952,P=0.006 1,圖2)。

圖1 生物信息學(xué)分析結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達(dá),*P<0.05

圖2 結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達(dá)

表1 3對(duì)結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA測(cè)序分析

2.2 FOXA3蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系采用免疫組化法檢測(cè)120例結(jié)直腸癌組織中FOXA3蛋白表達(dá)(圖3),統(tǒng)計(jì)分析顯示,FOXA3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),高表達(dá)FOXA3的患者易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)。FOXA3表達(dá)與組織分化程度呈負(fù)相關(guān),高表達(dá)FOXA3的患者組織分化程度低(P=0.006)。FOXA3表達(dá)與患者性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小和組織類(lèi)型均無(wú)關(guān)(表2)。

AB

表2 FOXA3蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 FOXA3表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系單因素生存分析顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和FOXA3表達(dá)與預(yù)后相關(guān)(表3),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者預(yù)后差(P<0.000 1),腫瘤分化程度低的患者預(yù)后差(P=0.049),高表達(dá)FOXA3的患者預(yù)后差(P=0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示,FOXA3低表達(dá)患者總生存期高于FOXA3高表達(dá)患者(圖4)。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析FOXA3表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

表3 Cox回歸模型分析結(jié)直腸癌預(yù)后危險(xiǎn)因素

將Cox單因素生存分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及FOXA3表達(dá)等指標(biāo)納入Cox多因素分析,同時(shí)將性別、年齡作為校正因素納入分析,結(jié)果顯示,FOXA3表達(dá)是結(jié)直腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=0.453,95%CI=0.209～0.982,P=0.045,表3)。

3 討論

叉頭框家族蛋白擁有一段保守的110個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)構(gòu)域[7],包含19個(gè)亞家族,由100多個(gè)成員組成,分別以FOXA-FOXS命名。FOX家族中FOXA是作用最廣泛、研究最深入的一個(gè)亞家族,廣泛存在于真菌和動(dòng)物體內(nèi),該家族蛋白在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、能量代謝以及免疫調(diào)節(jié)等均發(fā)揮重要的生理作用。FOXA由FOXA1、FOXA2和FOXA3三個(gè)成員組成,FOXA3也叫FKHH3、HNF3G或TCF3G,人類(lèi)FOXA3定位于染色體19q13.32。

近年,FOXA3在癌癥中作用的研究越來(lái)越受到重視。研究表明,FOXA3在肝癌、食管癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展中均起到一定作用[8-19]。Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn),FOXA3在肝癌組織中的表達(dá)顯著降低,FOXA3降低可能是由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14介導(dǎo)的m6A甲基化修飾所調(diào)控。FOXA3高表達(dá)患者總生存率高。另有研究團(tuán)隊(duì)[12-13]也得到類(lèi)似的結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn)FOXA3可與HNF1A、HNF4A協(xié)同作用,使肝癌細(xì)胞喪失惡性特征,從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA DACT3-AS1可通過(guò)促進(jìn)FOXA3和HDAC2相互作用,使FOXA3去乙酰化,降低FOXA3的表達(dá),導(dǎo)致FOXA3抑制PKM2的作用降低,促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。但也有研究發(fā)現(xiàn)[15],FOXA3可以通過(guò)上調(diào)AFP和HNF1A/MYC和下調(diào)ZFHX3的表達(dá),促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展。上述研究提示,FOXA3在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能通過(guò)不同調(diào)控機(jī)制在抑癌和促癌中起雙重作用。

Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn),FOXA3在肺癌組織中表達(dá)水平升高,且患者總生存率較差。Guo等[4]推測(cè)FOXA3可能與突變的KRAS協(xié)同誘導(dǎo)侵襲性肺黏液腺癌(invasive mucinous adenocarcinoma, IMA)的發(fā)生。這表明FOXA3在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起促癌作用。

FOXA3在食管癌中的作用也有相關(guān)研究。Chen等[17]研究發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,FOXA3在食管癌和Barrett食管組織中的表達(dá)顯著上調(diào),FOXA3上調(diào)與腫瘤侵襲和晚期TNM分期顯著相關(guān)。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FOXA3下調(diào)能顯著抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但張偲昂[18]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXA3在食管鱗癌中顯著下調(diào),FOXA3低表達(dá)患者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),FOXA3低表達(dá)是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,上調(diào)FOXA3的表達(dá),食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖能力和遷移能力顯著下降。這些研究表明,與肝癌類(lèi)似,FOXA3可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中通過(guò)不同機(jī)制起促癌和抑癌的雙重作用。

目前,有關(guān)FOXA3在結(jié)直腸癌中作用的研究報(bào)道較少。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn),FOXA3在奧沙利鉑治療敏感的結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)比耐藥患者癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。FOXA3表達(dá)下調(diào)的患者,總生存率或無(wú)瘤生存率均較差。FOXA3表達(dá)下調(diào)可顯著提高結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活和干細(xì)胞樣特性。進(jìn)一步機(jī)制研究表明,在結(jié)直腸癌中FOXA3對(duì)奧沙利鉑化療敏感是通過(guò)抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1, MACC1)實(shí)現(xiàn)的。該研究提示,FOXA3可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起抑癌作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),FOXA3 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果與之一致,提示FOXA3在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到一定的作用。進(jìn)一步采用免疫組化法檢測(cè)FOXA3表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)FOXA3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),高表達(dá)FOXA3的患者易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。FOXA3表達(dá)與組織分化程度呈負(fù)相關(guān),高表達(dá)FOXA3的患者組織分化程度低,而FOXA3表達(dá)與患者性別、年齡、發(fā)病部位、腫瘤大小和組織類(lèi)型均無(wú)關(guān)。Cox單因素生存分析顯示,FOXA3表達(dá)與預(yù)后相關(guān),高表達(dá)FOXA3的結(jié)直腸患者預(yù)后差,生存期短(P=0.001)。Cox多因素分析顯示,FOXA3表達(dá)是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

研究表明[21],癌癥的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多分子、多通路間錯(cuò)綜復(fù)雜、相互作用的結(jié)果,同一基因可能通過(guò)參與不同機(jī)制在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到抑癌和促癌的雙重作用。本研究推測(cè)FOXA3在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起促癌作用,而上述Li等的研究表明FOXA3可能通過(guò)抑制腫瘤干性和增強(qiáng)化療敏感在結(jié)直腸癌中起抑制作用,提示其與FOXA3在肝癌、食管癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的雙重作用類(lèi)似,FOXA3在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中也可能起抑癌和促癌的雙重作用,這種雙重作用可能與信號(hào)通路、腫瘤代謝和免疫微環(huán)境等差異相關(guān)?？傊?FOXA3在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的復(fù)雜性、確切的功能和機(jī)制還需積累更多的研究加以補(bǔ)充和完善。

本研究通過(guò)探討FOXA3表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)FOXA3可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。FOXA3高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后不良,這些促癌現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是對(duì)FOXA3在結(jié)直腸癌中的作用有益補(bǔ)充,為進(jìn)一步研究FOXA3的功能和機(jī)制提供了良好的理論基礎(chǔ)和方向,并可能為結(jié)直腸癌的早期診斷和個(gè)體化靶向治療提供新的靶點(diǎn),對(duì)結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。