蒼術酮通過調節Nrf2-NLRP3通路減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷實驗研究*

陳天陽 李鵬程 嚴 佳 鄭佳萍 金源源 成 揚 王 倩

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 210203）

急性肺損傷（ALI）及其更嚴重的形式急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由各種原因所導致的肺組織結構發生特征性病理改變而出現的臨床綜合征，其主要由敗血癥、胰腺炎、多發性創傷、肺炎或吸入有害氣體等引發［1-2］。氧化應激是體內許多疾病始發的關鍵因素，機體內氧化還原反應調節失衡是眾多疾病的病理生理基礎。核因子NF-E2相關因子（Nrf2）氧化應激通路中最重要的調節因子之一，在應對各種細胞應激時從細胞質釋放并轉位到細胞核，發揮抗炎及抗損傷、抑制氧化應激反應與調節細胞凋亡等作用［3-4］。NLRP3炎性小體作為先天免疫系統的重要組成部分，在抗感染宿主防御中具有重要作用，而其異常激活與ALI 的發生發展密切相關［5］。

蒼術酮是從中藥蒼術中分離出的倍半萜類化合物，作為蒼術的主要成分之一，具有抗腫瘤、降血壓、抗炎鎮痛、抗氧化、保肝、抗流感病毒、除螨等作用［6］。課題組前期研究發現，蒼術酮對ALI 具有保護作用［7-8］。本研究通過構建LPS誘導ALI小鼠模型，使用不同劑量蒼術酮處理后，測定相關指標，旨在從Nrf2-NLRP3 信號通路揭示蒼術酮對ALI小鼠的保護作用機制，為蒼術酮在臨床上治療ALI提供實驗依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠48 只，6～8 周齡，體質量（22±3）g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號：SCXK（浙）2019-0001。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。本實驗遵循3R保護原則，經上海中醫藥大學倫理委員會批準，批準號：PZSHUTCM2303200003。

1.2 試藥與儀器

蒼術酮（源葉，純度≥85%），地塞米松（源葉），LPS（上海碧云天）、白細胞介素-1β（IL-1β）（江萊生物）、白細胞介素-6（IL-6）（ABclonal）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（上海碧云天），白細胞介素-10（IL-10）（ABclonal），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）（源葉），丙二醛（MDA）（索萊寶Solarbio），超氧化物歧化酶（SOD）（源葉），抗髓過氧化物酶抗體（MPO）（士鋒生物），Trizol 裂解和提取試劑盒（上海Biotechnology 公司），cDNA 合成試劑盒（大連Takara 公司），實時定量PCR儀（美國ABI，StepOne Plus）。

1.3 分組與給藥

48 只小鼠隨機分為6 組：對照組、模型組、地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組，每組各8 只。地塞米松組以10 mg/kg 灌胃，蒼術酮低、中、高劑量組分別按10、20、40 mg/kg 灌胃，正常組和模型組以等量生理鹽水灌胃，連續7 d。

1.4 模型制備

給藥7 d 后進行造模，造模前24 h 禁食不禁水。第7 天當天灌胃2 h 后實驗組予以氣管內注射LPS（10 mg/kg）造模6 h，正常組注射相同容量的生理鹽水。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 ELISA 檢測肺泡灌洗液中炎癥因子 取小鼠肺泡灌洗液［9］，并按試劑盒說明書進行白細胞介素-1β（IL-1β）、IL-6和TNF-α含量的檢測。

1.5.2 ELISA檢測血清中炎癥因子 離心小鼠血清，按試劑盒說明書進行IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平檢測。

1.5.3 肺濕干質量比的測定 取肺組織，除去右肺上葉組織的水分和部分血液后稱量，記為W，再將其置于60 ℃的恒溫烘箱中烘干至恒重稱量，記為D。計算濕/干質量比值（W/D）。

1.5.4 肺組織MPO 表達檢測 剪取適量肺組織，置于預冷過的玻璃組織勻漿器中，在冰浴上制成5%勻漿液，按照相關說明書操作步驟檢測MPO表達。

1.5.5 肺組織GSH-Px、MDA、SOD 測定 取適量右肺組織剪碎后勻漿、離心，并收取上清液按照試劑盒說明書檢測GSH-Px、MDA、SOD水平。

1.5.6 肺組織病理學 取小鼠右肺下葉，4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，切片厚度為5 μm，根據流程進行脫蠟及水化，然后進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。拍照肺泡壁厚度、肺組織破壞、炎癥細胞浸潤情況進行評分［10］。

1.5.7 RT-qPCR檢測 肺組織中Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 取適量右肺組織于滅菌的離心管中，根據說明書使用Trizol 法提取總RNA，使用PrimeScriptRTReagent Kit 進行cDNA 合成，使用SYBRPremixExTaq 進行熒光定量PCR 實驗。本研究使用的特異性引物由上海生工公司合成，見表1。PCR 反應體系為20 μL，步驟為預變性95 ℃30 s，PCR反應（95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環），使用2-ΔΔct法檢測mRNA表達水平。

表1 RT-qPCR指標引物序列表

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

見表2。與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組IL-1β、IL-6 和TNFα 含量顯著降低（P＜0.05）；蒼術酮高劑量組與地塞米松組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與地塞米松組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別對照組模型組地塞米松組蒼術酮低劑量組蒼術酮中劑量組蒼術酮高劑量組n888888 IL-1β 195.68±13.07 834.16±25.79*467.27±18.36*#609.27±17.28*#436.91±20.16*#398.26±21.81*#△IL-6 167.98±15.37 762.30±27.21*506.13±20.48*#562.37±25.36*#521.08±19.54*#458.03±22.59*#△TNF-α 104.56±14.67 485.17±23.28*346.21±21.72*#358.43±22.91*#330.18±18.82*#318.09±17.78*#△

2.2 各組小鼠血清中炎癥因子水平比較

見表3。與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組IL-1β、IL-6 和TNF-α含量顯著降低（P＜0.05）；IL-10 水平顯著升高（P＜0.05）；蒼術酮高劑量組與地塞米松組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清中炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組 別對照組模型組地塞米松組蒼術酮低劑量組蒼術酮中劑量組蒼術酮高劑量組n888888 IL-1β 19.26±4.29 78.49±11.33*40.12±8.16*#58.02±9.39*#46.62±7.83*#35.29±8.04*#△IL-6 12.45±3.02 51.26±7.29*39.37±5.53*#41.92±6.32*#34.07±4.72*#30.56±4.34*#△TNF-α 6.14±1.34 21.46±4.27*14.70±3.01*#16.72±3.20*#14.29±2.87*#10.36±2.69*#△IL-10 4.78±1.27 1.61±0.82*2.78±0.91*#2.17±0.89*#2.80±1.02*#3.33±1.16*#△

2.3 各組小鼠肺組織病理學及評分

見表4。與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮組肺泡壁毛細血管擴張充血減輕，肺泡間隔增寬減少，肺泡腔水腫減少，炎癥細胞浸潤減少，見圖1。與對照組比較，模型組、地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組肺組織病理評分明顯提高（P＜0.05），與模型組比較，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組病理評分降低（P＜0.05）。

表4 各組病理評分、W/D、MPO水平比較（±s）

表4 各組病理評分、W/D、MPO水平比較（±s）

組 別對照組模型組地塞米松組蒼術酮低劑量組蒼術酮中劑量組蒼術酮高劑量組n888888病理評分（分）1.68±0.12 7.85±0.30*4.76±0.21*#5.31±0.19*#4.83±0.18*#3.86±0.20*#△W/D 3.32±0.30 6.63±0.69*4.78±0.76*#5.11±0.61*#4.60±0.75*#4.08±0.48*#△MPO（U/g）1.01±0.19 1.57±0.31*1.26±0.25*#1.40±0.20*#1.22±0.19*#1.09±0.16*#△

2.4 各組小鼠肺組織W/D和MPO水平比較

見表4。與對照組相比，模型組W/D、MPO 顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組W/D、MPO 顯著降低（P＜0.05）；蒼術酮高劑量組W/D、MPO 與地塞米松組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠肺組織中GSH-Px、MDA、SOD水平比較

見表5。與對照組相比，模型組MDA 水平顯著升高（P＜0.05），GSH-Px、SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；GSH-Px、SOD 水平顯著升高（P＜0.05）；蒼術酮高劑量組與地塞米松組差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表5 各組小鼠肺組織中GSH-Px、MDA、SOD水平比較（U/g，±s）

表5 各組小鼠肺組織中GSH-Px、MDA、SOD水平比較（U/g，±s）

組 別對照組模型組地塞米松組蒼術酮低劑量組蒼術酮中劑量組蒼術酮高劑量組n888888 GSH-Px 122.53±20.13 71.82±18.54*93.27±19.37*#89.68±17.09*#97.56±19.20*#108.43±21.73*#△MDA 1.86±0.17 3.59±0.49*2.58±0.26*#2.61±0.23*#2.45±0.21*#2.27±0.15*#△SOD 50.06±4.21 19.67±3.89*39.15±2.83*#31.12±3.65*#40.72±3.45*#45.98±3.76*#△

2.6 各組小鼠肺組織中Nrf2、HO-1、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達比較

見表6。與對照組相比，模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組及蒼術酮低、中、高劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 含量顯著降低（P＜0.05）；Nrf2、HO-1 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）；蒼術酮高劑量組與地塞米松組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表6 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18 mRNA表達水平比較（±s）

表6 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18 mRNA表達水平比較（±s）

組別對照組模型組地塞米松組蒼術酮低劑量組蒼術酮中劑量組蒼術酮高劑量組n888888 Nrf2 1.02±0.13 0.35±0.06*0.67±0.09*#0.56±0.07*#0.78±0.10*#0.93±0.11*#△HO-1 1.03±0.12 0.43±0.07*0.69±0.08*#0.59±0.08*#0.82±0.09*#0.96±0.12*#△NLRP3 0.98±0.08 3.83±0.34*2.41±0.25*#2.56±0.18*#1.79±0.16*#1.59±0.14*#△Caspase-1 1.02±0.09 4.41±0.30*2.72±0.28*#2.90±0.23*#2.41±0.22*#2.02±0.16*#△ASC 1.01±0.07 4.62±0.24*3.09±0.21*#3.24±0.22*#2.91±0.19*#2.38±0.17*#△IL-1β 1.02±0.06 5.82±0.38*4.52±0.30*#4.79±0.28*#4.17±0.23*#3.72±0.20*#△IL-18 1.01±0.05 5.36±0.33*3.93±0.24*#4.14±0.22*#3.66±0.19*#3.17±0.14*#△

3 討 論

ALI 的發病機制錯綜復雜，目前西醫治療以原發病的治療、呼吸支持、激素治療為主，總體上缺乏特效的藥物及方法，不能達到理想的治療效果，故臨床上病死率依然很高［11］。近年來隨著中藥在ALI治療中的應用，通過多環節、多靶點作用可以取得更佳的療效，又為其治療提供了新的突破口［12-13］。前期研究發現，蒼術酮對ALI 小鼠具有保護作用，但其具體作用機制不明確，本研究在此基礎上，通過生化方法及分子生物學方法進一步探究蒼術酮對ALI的干預機制。

呼吸道作為參與整個機體代謝和維持生命活動的重要器官之一，是人體直接與外界相通的一個特別器官，當受到活性氧化物刺激，可引起氧化還原失衡從而產生炎癥。MPO 是中性粒細胞嗜天青顆粒所釋放的過氧化物酶類，其活性的高低與炎癥反應相關［14］。SOD 是氧自由基的清除劑，其活力高低間接反映機體清除氧自由基的能力。MDA 是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸所形成的脂質過氧化物，它的增加表明器官組織內存在脂質過氧化損傷［15］。GSH-Px 作為一種重要的過氧化物分解酶可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，保護細胞膜的結構和功能的完整性［16］。本研究發現，模型組小鼠肺組織MPO、MDA 水平升高，GSH-Px、SOD 水平降低，而蒼術酮能夠降低ALI 小鼠肺泡灌洗液及血清中炎癥因子表達，提高W/D 比值、降低肺組織MPO 活性及MDA 表達，升高SOD、GSH-Px表達，同時可顯著改善肺組織損傷，說明蒼術酮可以調節氧化應激改善小鼠肺損傷。

相關研究發現ALI 和ARDS 發病機制與氧化應激有關，而Nrf2 在其中扮演重要角色［17］。研究表明Nrf2敲除的小鼠急性肺損傷的程度更重，提示Nrf2 是ALI保護的關鍵靶點［18］。NLRP3 炎性小體主要表達于免疫細胞，其激活后導致IL-1β/18 的產生，促進細胞因子風暴（IL-6/8/10/1RA、TNF-α 和CXCL10）的形成，從而加劇肺內皮和肺泡損傷［19-20］。研究發現，在肺損傷的大鼠模型中，可通過Nrf2 途徑抑制NLRP3 炎性小體的激活，從而減少肺損傷大鼠模型中肺炎癥細胞浸潤和炎性細胞因子的水平［21］。本研究結果發現，模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 水平顯著升高，Nrf2、HO-1 mRNA 水平顯著降低，蒼術酮可顯著提高ALI 小鼠肺組織Nrf2、HO-1 mRNA 的表達，抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA 水平，提示蒼術酮可能通過上調Nrf2 表達，抑制NLRP3 炎癥小體的活性，進而抑制炎癥因子的釋放，從而減輕小鼠肺損傷程度。

綜上所述，本研究結果表明蒼術酮預處理對LPS誘導小鼠ALI 具有較強的保護作用，其作用機制可能與通過調控Nrf2-NLRP3 信號通路改善氧化應激水平及抑制炎癥因子釋放有關。但本研究不足之處缺乏體外研究，我們接下來將進一步探究蒼術酮在體外對該信號通路調控，為開發防治ALI藥物打下基礎。