大半夏湯提取物對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及JAK1/STAT3通路的影響*

馬燕凌 葉子豪 晏 菲 魏武杰 李 黎 劉 莉 孫建海

（江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

食管癌是起源于食管內(nèi)任何部位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，預(yù)后較差，造成了極大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。目前以外科為主的綜合治療是食管癌的主要治療措施，但仍無(wú)法獲得滿意的治療效果，5年生存率不及25%［1］。近年來(lái)中醫(yī)藥在惡性腫瘤的治療方面獲得了認(rèn)可。食管癌屬于中醫(yī)學(xué)“噎膈”范疇，中醫(yī)理論認(rèn)為噎膈病機(jī)為痰瘀互結(jié)，致食道狹窄，病久則耗傷精血，以致血枯津涸，因此行氣散結(jié)、降逆化痰為治療之法［2］。大半夏湯出自《金匱要略》，有開(kāi)結(jié)降逆、化痰理氣之功。王克窮等［3］以“益氣化痰和胃”理論為依據(jù)，使用大半夏湯治療食管癌等病癥，效果顯著，但關(guān)于食管癌治療的具體機(jī)制仍未明確。酪氨酸蛋白激酶1（JAK1）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)人食管癌微環(huán)境下未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)皮樣分化［4］。亦有研究認(rèn)為JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡［5］，但關(guān)于大半夏湯干預(yù)食管癌的分子機(jī)制是否與JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)仍未明確。故此，本研究以STAT3 信號(hào)通路抑制劑Stattic 作為陽(yáng)性對(duì)照，以離體培養(yǎng)的人食管癌EC9706 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探索大半夏湯通過(guò)STAT3信號(hào)通路干預(yù)食管癌EC9706細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人食管癌EC9706細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）、大半夏湯參照《金匱要略》組方：生半夏260 g，人參45 g，白蜜126 g。藥材均購(gòu)自河南張仲景大藥房股份有限公司，并經(jīng)鑒定為真品；酪氨酸蛋白激酶抑制劑（Stattic）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO 公司；小牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；JAK1、STAT3抗體、磷酸化JAK1（p-JAK1）、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，Trizol RNA 抽提試劑盒購(gòu)自北京索寶來(lái)科技有限公司。E-Gel Imager 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，M500 熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司、CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司、HaierHXC-158型低溫冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司，8 μm Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 大半夏湯藥物混合后加入乙酸乙酯提取。水浴加熱至85 ℃之后回流提取4 h，少冷卻后減壓蒸餾，去除溶劑，獲得的濃縮物經(jīng)低溫減壓干燥至干浸膏狀（含水量＜10%），以二甲基亞砜（DMSO）充分溶解，配置為100 mg/mL 原液，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾、滅菌，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌EC9706 細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，常規(guī)條件培養(yǎng)（5% CO2，37 ℃），細(xì)胞單層貼壁后經(jīng)胰酶消化重懸培養(yǎng)傳代，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)大半夏湯提取物、Stattic 對(duì)EC906細(xì)胞增殖影響 大半夏湯提取物（200、100、50、25、12.5 μg/mL）、Stattic（4、3.5、3、2.5、2 μmol/L）使用RPMI1640 稀釋。EC9706 細(xì)胞以1×108/L 密度接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別加入各濃度藥物，每個(gè)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，再次孵育48 h，每孔加入MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，丟棄MTT 溶液，加DMSO 溶液150 μL，震蕩后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 處吸光度（OD值），計(jì)算不同濃度半夏湯提取物、Stattic溶液對(duì)EC906細(xì)胞的抑制率，抑制率=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-對(duì)照組OD值）÷實(shí)驗(yàn)組OD值×100%，曲線擬合計(jì)算大半夏湯提取物、Stattic的IC50值。

1.2.4 細(xì)胞分組及干預(yù) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期食管癌EC9706細(xì)胞以1×106個(gè)接種于6 孔板，常規(guī)條件培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)基，分為大半夏湯組、Stattic組、大半夏湯+Stattic 組及空白對(duì)照組。大半夏湯組、Stattic 組分別給予大半夏湯提取物、Stattic 濃度為IC50值濃度；大半夏湯+Stattic 組給予含大半夏湯提取物和Stattic IC50值濃度；空白對(duì)照組未做特殊處理。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 參照“1.2.3”檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h OD值，OD值越高表示細(xì)胞活性越高。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞消化后洗滌，繼續(xù)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿后，棄培養(yǎng)基，以10 μL槍頭劃線，PBS輕柔沖洗，于顯微鏡下記錄劃痕寬度（0 h），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，再次經(jīng)PBS輕柔沖洗，顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度（24 h），以Image-ProPlus6.0 計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組GES-1細(xì)胞侵襲能力吸取各組細(xì)胞100 μL 接種于8 μm 孔徑含有液態(tài)Matrigel基質(zhì)膠的小室上室，下室加入10%FBS的培養(yǎng)基中，繼續(xù)常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h，24 h 后PBS 洗滌、甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下（400 倍）隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.2.8 qRT-PCR 法檢測(cè) Trizol 試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 為反應(yīng)液配置。擴(kuò)增，進(jìn)行預(yù)變性、變性、退火和延伸（條件：95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s、72 ℃、30 s），40個(gè)循環(huán)，單樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，U6、GAPDH 為內(nèi)參，紫外線下觀察電泳結(jié)果，以2-ΔΔct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 Western blotting 法檢測(cè) 各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液裂解，1 400 r/min 離心5 min，離心半徑30 cm，取上清，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST 稀釋蛋白一抗，室溫下封閉孵育2 h，二抗稀釋后室溫下孵育1 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，暗室中顯影、定影，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大半夏湯提取物、Stattic 對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞的抑制率

見(jiàn)表1。不同濃度的大半夏湯提取物、Stattic 對(duì)EC9706 細(xì)胞的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著干預(yù)濃度的增加，抑制率明顯增加（P＜0.05）。擬合細(xì)胞抑制率-濃度曲線，結(jié)果顯示大半夏湯提取物與Stattic 的曲線擬合優(yōu)度結(jié)果均為優(yōu)（R2=0.957、0.961），達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，其IC50值分別為98.50 μg/mL、3.82 μmol/L。

表1 不同濃度大半夏湯提取物、Stattic對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞的抑制率比較（%，±s）

表1 不同濃度大半夏湯提取物、Stattic對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞的抑制率比較（%，±s）

注：與12.5 μg/mL 及2 μmol/L 比較，*P ＜0.05；與25 μg/mL 及2.5 μmol/L 比較，#P ＜0.05；與50 μg/mL 及3 μmol/L 比較，△P ＜0.05；與100 μg/mL及3.5 μmol/L比較，▲P ＜0.05。

抑制率12.33±2.01 15.20±2.80 22.55±3.50*#46.33±5.00*#△56.20±6.00*#△▲大半夏湯提取物12.5 μg/mL 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL抑制率20.02±3.50 25.33±4.50 36.42±5.30*#54.50±6.00*#△65.33±7.80*#△▲Stattic 2 μmol/L 2.5 μmol/L 3 μmol/L 3.5 μmol/L 4 μmol/L

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較，大半夏湯組、Stattic組、大半夏湯+Stattic 組的OD 值均更低（P＜0.05）；與Stattic 組和大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組的OD值更低（P＜0.05）；Stattic 組與大半夏湯組的OD 值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與Stattic組比較，#P ＜0.05；與大半夏湯組比較，△P ＜0.05。下同。

OD值1.20±0.40 0.80±0.25*0.70±0.20*0.40±0.10*#△組 別空白對(duì)照組Stattic組大半夏湯組大半夏湯+Stattic組n5555

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較

見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較，大半夏湯組、Stattic組、大半夏湯+Stattic 組的遷移率更低（P＜0.05）；與Stattic 組及大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組的遷移率更低（P＜0.05）；Stattic 組與大半夏湯組的遷移率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組細(xì)胞遷移率比較（%，±s）

表3 各組細(xì)胞遷移率比較（%，±s）

組 別空白對(duì)照組Stattic組大半夏湯組大半夏湯+Stattic組n5555遷移率30.30±4.50 22.30±3.33*20.12±4.00*10.33±3.10*#△

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較

見(jiàn)表4。與空白對(duì)照組比較，大半夏湯組、Stattic組、大半夏湯+Stattic 組的侵襲數(shù)量更低（P＜0.05）；與Stattic 組及大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組的侵襲數(shù)量更低（P＜0.05）；Stattic 組與大半夏湯組的侵襲數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組細(xì)胞侵襲能力比較（個(gè)/視野，±s）

表4 各組細(xì)胞侵襲能力比較（個(gè)/視野，±s）

組 別空白對(duì)照組Stattic組大半夏湯組大半夏湯+Stattic組n5555侵襲數(shù)量200.02±30.50 150.33±20.20*140.45±22.00*100.01±15.50*#△

2.5 各組細(xì)胞JAK1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)情況比較

見(jiàn)表5。與空白對(duì)照組比較，大半夏湯組、Stattic組、大半夏湯+Stattic 組的JAK1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)量更低（P＜0.05）；與Stattic組及大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組的JAK1 mRNA、STAT3 mRNA 表達(dá)量更低（P＜0.05）；Stattic 組與大半夏湯組的JAK1 mRNA、STAT3 mRNA 表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組細(xì)胞JAK1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組細(xì)胞JAK1 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

組 別空白對(duì)照組Stattic組大半夏湯組大半夏湯+Stattic組n5555 JAK1 mRNA 2.33±0.60 2.30±0.50*1.80±0.40*1.00±0.30*#△STAT3 mRNA 1.85±0.30 0.80±0.20*1.05±0.22*0.20±0.05*#△

2.6 各組細(xì)胞JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)表6、圖1。與空白對(duì)照組比較，大半夏湯組與大半夏湯+Stattic 組p-JAK1 蛋白表達(dá)量更低（P＜0.05）；與大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組p-JAK1蛋白表達(dá)量更低（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，Stattic 組、大半夏湯組、大半夏湯+Stattic 組的p-STAT3 蛋白表達(dá)量更低（P＜0.05）；與Stattic 組及大半夏湯組比較，大半夏湯+Stattic 組的p-STAT3 蛋白表達(dá)量更低（P＜0.05）。各組JAK1 與STAT3 蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組細(xì)胞JAK1、STAT3蛋白表達(dá)條帶

表6 各組細(xì)胞JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組細(xì)胞JAK1、STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別空白對(duì)照組Stattic組大半夏湯組大半夏湯+Stattic組n5555 JAK1 1.10±0.15 1.02±0.15 0.98±0.10 0.95±0.08 p-JAK1 0.90±0.15 0.80±0.10 0.60±0.08*#0.58±0.08*#△STAT3 0.72±0.13 0.78±0.10 0.75±0.08 0.70±0.08 p-STAT3 0.70±0.12 0.20±0.05*0.25±0.06*0.10±0.02*#△

3 討 論

國(guó)際癌癥研究結(jié)果顯示，2018 年全球食管癌的發(fā)病率和死亡率分別達(dá)到了3.2%和5.3%，全世界每年約有30 萬(wàn)人死于食管癌［6］。我國(guó)是食管癌高發(fā)地區(qū)，2019年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)顯示，我國(guó)2015年的食管癌發(fā)病率為24.6 萬(wàn)，發(fā)病率為17.8%，居于惡性腫瘤的第6 位，死亡率為18.8 萬(wàn)例，居于惡性腫瘤的第4 位［7］。中國(guó)食管癌負(fù)擔(dān)分析顯示，從1990 至2019 年，我國(guó)的食管癌疾病負(fù)擔(dān)得到有效控制，但因人口老齡化的加重，食管癌的防治仍面臨重大挑戰(zhàn)［8］。近年來(lái)對(duì)食管癌的研究有了一定進(jìn)展，西醫(yī)聯(lián)合中醫(yī)藥治療的綜合療法成為食管癌治療方式的主流。通過(guò)中醫(yī)藥的參與治療，在提高治療效果、減少手術(shù)及放化療副作用、提高患者生存質(zhì)量方面有明顯獲益。

本研究以大半夏湯提取物干預(yù)食管癌EC9706 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠抑制食管癌EC9706 細(xì)胞的增殖，且其作用具有濃度依賴性，計(jì)算抑制率-擬合曲線，以IC50濃度大半夏湯提取物干預(yù)食管癌EC9706細(xì)胞后，OD值、細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)量均降低，說(shuō)明大半夏湯可抑制食管癌EC9706細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。大半夏湯主治胃反（反酸、惡心、嘔逆、消化不良等癥），近年來(lái)將其應(yīng)用于惡性腫瘤化療嘔吐及腫瘤晚期惡液質(zhì)的治療中獲得了較滿意的效果［9-10］。大半夏湯藥物組成為生半夏、人參及白蜜，方中半夏入脾胃及肺經(jīng)，能降逆止嘔、消痞散結(jié)、燥濕化痰，為止嘔之要藥；蜂蜜歸脾、肺及大腸經(jīng)，可補(bǔ)中緩急、潤(rùn)燥、解毒；人參可大補(bǔ)元?dú)狻⑸虬采瘛Ｒ陨纤幬锖嫌眠_(dá)到補(bǔ)中益氣、降逆化痰、消痞散結(jié)的功效。藥理研究表明，人參能增強(qiáng)人體免疫力、清除氧自由基，并有抗腫瘤的作用［11-12］。半夏中的有效物質(zhì)可抑制延腦嘔吐中樞控制嘔吐［13］，熊常州等［14］研究顯示，半夏的KEGG 信號(hào)通路富集涉及癌癥通路、腫瘤蛋白多糖、PI3K/Akt 信號(hào)通路、癌癥的MicroRNAs、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和化學(xué)致癌等信號(hào)通路，并認(rèn)為半夏可能通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路、增強(qiáng)化療藥物敏感性和抗化療耐藥等方面來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到防治肺癌的作用。白蜜中含有多酚化合物、有機(jī)酸、酶、蛋白質(zhì)、類黃酮、抗菌肽等成分，有消炎、殺菌、抗氧化、抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性及中度抗腫瘤和顯著抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用［15-16］。上述研究證實(shí)了大半夏湯具有良好的抗癌作用。

癌癥的發(fā)生與多種信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在人類腫瘤、心血管疾病及惡性白血病中JAK-STAT 信號(hào)通路的異常持續(xù)激活，且其蛋白水平可作為疾病檢測(cè)指標(biāo)［17］。STAT3 是一類具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及免疫反應(yīng)等功能的轉(zhuǎn)錄因子，為JAK-STAT 信號(hào)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并參與腫瘤的增殖、分化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等生理功能的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，活化STAT3 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中接受細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的刺激而活化，活化后的STAT3蛋白隨后進(jìn)入細(xì)胞核中與相應(yīng)的下游靶基因位點(diǎn)相結(jié)合，從而引起下游靶基因的異常表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化［18］。本研究中發(fā)現(xiàn)STAT3 抑制劑干預(yù)Stattic 作用食管癌EC9706 細(xì)胞后，細(xì)胞的抑制率上升，OD 值、細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)量均下降，說(shuō)明抑制JAK1/STAT3 通路能抑制食管癌的生長(zhǎng)。此外本研究中經(jīng)大半夏湯干預(yù)后的JAK1、STAT3 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，且大半夏湯與Stattic 聯(lián)合干預(yù)組的JAK1、STAT3 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量下降更為明顯，證實(shí)大半夏湯對(duì)食管癌的抑制作用與對(duì)JAK1/STAT3信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)。

綜上所述，大半夏湯提取物能抑制食管癌EC9706細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖，其機(jī)制可能與抑制JAK1/STAT3 通路的激活有關(guān)。本研究的不足之處在于，中藥湯劑大半夏湯的抑癌過(guò)程中涉及多個(gè)活性、多個(gè)作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，本研究對(duì)經(jīng)典的JAK1/STAT3通路進(jìn)行探討，后續(xù)仍需進(jìn)一步深入研究其他信號(hào)通路及作用靶點(diǎn)，為食管癌的治療提供更多的參考。