基于ERS 信號蛋白異常表達探討清肝降濁方治療NAFLD 的機制研究

丁云錄，薄天儒，王鐵成，李馳坤，李曉兵，歐喜燕，劉彥晶*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林國文醫院，長春 130012；3.長春金賽藥業有限責任公司，長春 130012）

隨著高脂高熱量食物在人們飲食結構中比重的日益增加，社會肥胖率呈現出大幅度增長趨勢，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）病發率也隨之提高，據目前調查數據顯示，我國NAFLD 新發人數比例以每年4%的速度增加，已成為威脅我國居民健康的第一大慢性肝病[1-3]。該病的發病機制尚不明確，并且現代醫學尚無理想的治療藥物，中醫學認為NAFLD 病位在肝，涉及脾腎，主要病機以肝脾腎功能失調為本，痰濕、瘀血交阻互結停積于肝而形成脂肪肝。而采用中醫藥治療本病在減少脂肪沉積、改善肝功、調節脂質代謝及降低不良反應方面具有獨到優勢，研究前景廣闊。

清肝降濁方是基于長春中醫藥大學附屬醫院的臨床驗方研制的一種預防治療脂肪肝的新型中藥制劑，療效顯著，但清肝降濁方干預NAFLD 的具體作用機制尚不明確。最新證據表明內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與NAFLD 的發病有極為密切的聯系，PERK/eIF2a/ATF4 信號通路是ERS 中參與脂質代謝調節和細胞凋亡的關鍵信號轉導通路，在NAFLD的形成過程中具有重要意義[4]。本次研究，清肝降濁方以PERK/eIF2a/ATF4 信號通路為基礎，檢測相關蛋白，從而明確其治療NAFLD 的作用機制，對于尋求NAFLD 更有效的治療方案及進一步發揚中醫藥的優勢有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動 物 SD 大鼠，SPF 級，雄性，體質量（220.1±13.6）g。自由攝食、飲水，分籠飼養，室溫（22±2）℃，日溫差：≤4 ℃，相對濕度：40%～70%，與相通房間的最小靜壓差：10 Pa，氨濃度≤14 mg/m3，噪音：≤60 dB，最低工作照度：150 Lm，晝夜暗交替時間：12 h/12 h。倫理許可證號：2021137。1.1.1 藥品 清肝降濁方（ 深棕褐色顆粒，20211215），長春中醫藥大學附屬醫院實驗中心。易善復，批號：CBJD333，國藥準字：H20059010，賽諾菲（北京）制藥有限公司產品。

1.1.2 試劑 堿性磷酸酶試劑盒（223741，10 mL×10支）、天冬氨酸氨基轉移酶試劑盒（221591，10 mL×10 支）、丙氨酸氨基轉移酶試劑盒（224961，10 mL×10 支）、總膽固醇檢測試劑盒（225351，10 mL×10支）、三酰甘油檢測試劑盒（224281，10 mL×10支），中生北控生物科技股份有限公司；總超氧化物歧化酶（T- SOD）測試盒，規格：50 管/48 樣，批號：20221018，游離脂肪酸（NEFA）測試盒，規格：50 管/48 樣，批號：20220915，丙二醛（MDA），規格：50管/48 樣，批號：20220927，南京建成生物工程研究所。ATF4抗體，規格：100 μg/mL，批號：D0581，eIF2a抗體，200 μg/mL，批號：C2473，CHOP 抗體，100 μg/mL，批號：S3627，Santa Cruz。

1.1.3 儀器 全自動分析儀（selectra junior），荷蘭威圖；酶標儀（BIO680），BIO RAD 公司；蛋白凝膠成像儀（TACON320），GE 公司；倒置熒光顯微鏡（IX71），OLYMPUS；高速冷凍離心機（Biofuge Stratos），德國賀利氏公司。

1.2 方法[5-10]

1.2.1 動物分組 將60 只SPF 級SD 雄性大鼠適應性喂養1 周后，稱重，按體質量大小編號，通過隨機數字表法，將實驗大鼠隨機分為正常對照組；脂肪肝模型組；易善復膠囊組；清肝降濁方設高、中和低3 個給藥劑量組。共6 組，每組10 只。

1.2.2 模型制備 正常對照組給予標準飼料飼養；其余各組均飼喂高脂飼料，高脂飼料配比（82.3%標準飼料+ 15%豬油+ 2%膽固醇+ 0.2%丙硫氧嘧啶+ 0.5%膽酸鈉），連續8 周。

1.2.3 給藥方法 從第9 周開始陽性對照組給予易善復懸浮液244.3 mg/kg 灌胃，清肝降濁方3 個劑量組給藥劑量分別為865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg，給藥方式為灌胃給藥，給藥體積均為10 mL/kg，模型組和正常對照組給予等體積10 mL/kg 蒸餾水灌胃，持續給藥4 周。

1.2.4 標本留取 給藥周期結束，大鼠禁食不禁水12 h，稱重、麻醉。腹主動脈取血，室溫靜置30 min，3 000 rpm離心15 min，分離血清。剪取肝臟，置于-80℃超低溫冰箱保存。肝組織勻漿樣本處理：準確稱取肝組織重量，按重量（g）:體積（mL）=1:9 的比例，加入9 倍體積的勻漿介質，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 轉/分，離心10 min，取上清液待測。

1.2.5 檢測指標 1）日常狀態觀察：每日定時觀察各組大鼠的進食及飲水情況、毛發色澤、活動情況、糞便性狀等，每周對大鼠稱重并記錄。2）肝功能指標AST、ALT、AKP 檢測、血清中TC、TG、NEFA 及肝組織勻漿中TC、TG 檢測、肝組織勻漿中SOD、MDA檢測，按試劑盒說明書操作檢測。3）蛋白免疫印跡（Western-blot），制備樣本：每個實驗組各取50 mg肝臟組織，加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸化抑制劑混合物，勻漿，離心（4 ℃，16 000 rpm，30 min）后取上清。制膠及電泳、轉膜及封閉、一抗孵育、二抗孵育，將PDF 從二抗稀釋液中取出繼續用TBST 漂洗，加入ECL 發光液后于凝膠成像儀上顯影拍照。檢測信號通路相關蛋白的表達水平，大鼠ATF4、eIF2a、CHOP 表達量。

1.3 統計學方法 試驗結果以均數±標準差（±s）表示，統計學處理方法采用組間t檢驗。

2 結果

2.1 對肝功能相關指標的影響 清肝降濁方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 給藥組動物血清AST、AKP、ALT 活性明顯低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。見表1。

表1 清肝降濁方對NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影響（± s，n = 10）

表1 清肝降濁方對NAFLD 大鼠血清AST、AKP、ALT 活性的影響（± s，n = 10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑量/（mg/kg） ALT 活性/（U/L） AST 活性/（U/L） AKP 活性/（U/L）正常對照組 — 30.15±7.03## 29.93±4.98## 149.07±18.80##模型對照組 — 75.79±20.24 61.55±20.20 284.31±48.01易善復膠囊組 244.3 48.98±16.71## 40.02±15.54# 216.08±47.37##清肝降濁方組 865.1 38.39±19.50## 36.40±12.00## 154.87±50.50##清肝降濁方組 432.6 45.62±25.23## 39.93±11.07# 181.87±51.10##清肝降濁方組 216.3 54.75±22.86# 44.68±13.49# 197.66±91.67#

2.2 對血清及肝組織中TC、TG 含量的影響 清肝降濁方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 給藥組動物血清及肝勻漿中TC、TG 含量顯著低于模型對照組（P＜0.01或P＜0.05）；216.3 mg/kg 給藥組動物肝勻漿中TG 含量顯著低于模型對照組（P＜0.05）。見表2 和表3。

表2 清肝降濁方對NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影響（± s，n = 10）

表2 清肝降濁方對NAFLD 大鼠血清TC、TG、NEFA 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑量/（mg/kg） 血清TC/（mmol/L） 血清TG/（mmol/L） 血清NEFA/（μmol/L）正常對照組 — 2.48±0.30## 1.83±0.29## 494.70±89.06##模型對照組 — 4.01±0.93 3.15±0.86 862.55±212.37易善復膠囊組 244.3 3.11±0.54# 2.38±0.49# 575.28±133.04##清肝降濁方組 865.1 2.94±0.47# 2.18±0.42## 568.58±124.42##清肝降濁方組 432.6 3.05±0.76# 2.29±0.52# 662.71±140.48#清肝降濁方組 216.3 3.39±0.84 2.47±0.67 754.95±197.69

表3 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝組織中TC、TG 含量的影響（± s，n = 10）

表3 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝組織中TC、TG 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝組織TG/（mmol/L）正常對照組 — 3.61±0.68## 2.95±0.32##模型對照組 — 6.12±0.94 4.08±0.49易善復膠囊組 244.3 5.03±0.84# 3.25±0.57##清肝降濁方組 865.1 4.79±0.89# 3.21±0.44##清肝降濁方組 432.6 4.99±1.19# 3.52±0.60#清肝降濁方組 216.3 5.20±1.07 3.60±0.48#組別 劑量/（mg/kg）肝組織TC/（mmol/L）

2.3 對血清NEFA 含量、肝組織中MDA 含量及SOD活性的影響 NAFLD 肝損傷模型形成后，模型組動物血清NEFA 含量、肝組織MDA 含量明顯高于對照組，SOD 活性卻明顯低于對照組（P＜0.01）。清肝降濁方865.1 mg/kg 和432.6 mg/kg 2 個給藥組動物血清NEFA 含量及肝組織MDA 含量均明顯低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05）；而清肝降濁方制劑865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 給藥組動物肝組織SOD 活性卻明顯高于模型組（P＜0.01 或P＜0.05）。見表2 和表4。

表4 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝組織中SOD、MDA 含量的影響（± s，n = 10）

表4 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝組織中SOD、MDA 含量的影響（± s，n = 10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

肝組織MDA/（nmol/mgprot）正常對照組 — 178.34±45.28## 8.84±1.96##模型對照組 — 69.14±40.61 14.27±2.12易善復膠囊組 244.3 128.11±53.58# 12.02±3.07清肝降濁方組 865.1 162.99±31.54## 11.99±1.29#清肝降濁方組 432.6 151.54±28.18## 12.43±1.35#清肝降濁方組 216.3 115.22±48.52# 13.53±2.60組別 劑量/（mg/kg）肝組織SOD/（U/mgprot）

2.4 對肝組織ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表達的影響 清肝降濁方制劑865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 和216.3 mg/kg 3 個給藥組動物ATF4、CHOP 表達量明顯低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）；清肝降濁方865.1 mg/kg、432.6 mg/kg 2 個給藥組動物eIF2a 表達量明顯低于模型組（P＜0.05）。見表5。

表5 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表達的影響（± s，n = 10）

表5 清肝降濁方對NAFLD 大鼠肝中ATF4、eIF2a、CHOP蛋白表達的影響（± s，n = 10）

注：與模型對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

組別 劑 量/（mg/kg） ATF4 eIF2a CHOP正常對照組 — 0.11±0.01## 0.09±0.02## 0.13±0.03##模型對照組 — 0.77±0.18 0.83±0.12 0.98±0.08易善復膠囊組 244.3 0.61±0.12# 0.66±0.14# 0.87±0.10#清肝降濁方組 865.1 0.48±0.13## 0.56±0.13# 0.63±0.13##清肝降濁方組 432.6 0.59±0.09# 0.69±0.11# 0.78±0.11##清肝降濁方組 216.3 0.60±0.12# 0.74±0.10 0.87±0.14#

3 討論

非酒精性脂肪性肝病是常見的慢性肝病，指除外酒精、藥物、病毒或自身免疫性等確切因素而誘發的一系列肝臟疾病，NAFLD 治療手段受諸多因素影響，如飲食、腸道菌群、代謝、遺傳等，全世界總發病率呈現逐年增高態勢，因此，有效治療藥物的開發具有重要的臨床價值[11-13]。內質網可反映細胞發育、分化、內信號、蛋白質相互作用等細胞內部的變化，在細胞內脂質和膽固醇合成中也起著重要作用，內質網應激是非酒精性脂肪性肝病的關鍵發病機制[14-15]。本課題通過動物實驗觀察清肝降濁方對NAFLD的治療作用，并探討其與ERS 及其誘導的炎癥作用相關的機制。

本研究以高脂飲食喂養大鼠，脂代謝為主要調節因子，其影響是TC、TG 相應變化。結合表2 和表3，清肝降濁方治療后血清及肝組織中TC、TG 水平均顯著降低，證明清肝降濁方具有調節脂代謝的作用；結合表1 和表2 的結果，清肝降濁方可降低ALT、AST、AKP、NEFA 水平，可見清肝降濁方調節肝脂質轉運、增強肝功能；表4 實驗結果顯示清肝降濁方具有抗氧化活性，可通過降低大鼠肝組織MDA 水平，增加SOD 活性等抗氧化酶，改善非酒精性脂肪性肝大鼠肝臟氧化損傷。

PERK/eIF2a/ATF4 信號通路與NAFLD 形成存在著一定關系，在緩解內質網蛋白質代謝的壓力，減少細胞損傷方面具有重要意義。真核起始因子2a（eukaryotic initiation factor 2a，eIF2a），蛋白激酶介導的eIF2a 磷酸化可以增加ATF4 翻譯，eIF2a 活性降低，可以改善鼠的糖耐量和肝細胞脂肪變性；活性轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4） 是ERS 細 胞凋亡信號轉導的關鍵分子之一，ATF4 除參與許多生理病理過程，可以促進脂肪因子的分泌間接調節脂代謝；C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP），是ERS 介導細胞凋亡的主要轉錄調節因子，為PERK/eIF2a/ATF4 通路的下游效應因子，其蛋白表達主要以PERK/eIF2a/ATF4 途徑為主，研究證實阻斷該通路可抑制肝細胞凋亡，調節脂肪代謝[16-18]。本研究中，清肝降濁方能降低 NAFLD 模型大鼠中ERS相關蛋白 ATF4、eIF2a、CHOP 的表達，這提示清肝降濁方對 NAFLD 的改善作用可能是通過反饋性抑制ERS，而有利于緩解肝內脂代謝紊亂。

中藥治療NAFLD 具有顯著優勢，對NAFLD 具有治療和預防雙重作用，可以通過多種途徑進行綜合治療[19-21]。本次研究結果顯示，清肝降濁方能減少肝臟中過度沉積的脂質，降低血清肝酶、血脂，肝脂，有一定的保護肝臟、改善脂質代謝紊亂的作用；具有改善肝臟氧化應激狀態和脂質過氧化，減輕大鼠肝細胞脂肪變性的作用；明顯降低大鼠肝臟組織ATF4、eIF2a、CHOP 蛋白表達量，從而阻斷PERK/eIF2a/ATF4信號通路的激活，發揮對NAFLD 的治療作用，這可能是清肝降濁方防治NAFLD 的機制之一。