天然朱砂與合成朱砂的催眠藥效及急性毒性比較研究

成劍，袁媛，彭瑞潭，郁紅禮，3，4?，崔小兵

（1. 精華制藥集團股份有限公司，江蘇 南通 226000；2. 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023； 3. 江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023；4. 國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023）

朱砂（cinnabar）原名丹砂，始載《神農本草經》，別名辰砂，為天然礦物類辰砂族辰砂，主要化學成分為HgS，主產于湖南、貴州等地，其味甘，性微寒，可安神定驚，常用于心悸失眠等癥［1-2］。2020 版《中華人民共和國藥典》收載的朱砂來源為天然礦物辰砂，歷代文獻亦記載以天然朱砂作為藥用朱砂的來源。目前市場流通的朱砂除天然朱砂外亦有不少合成朱砂，合成朱砂又稱靈砂，是以水銀、硫黃為原料經加熱升華而成［3］。朱砂藥材經水飛法炮制成粉末后方可入藥［1］。課題組前期研究發現，天然朱砂與合成朱砂在水飛后粉末的外觀性狀、HgS 含量及晶型、物相構成方面均無明顯差異［4］。國家環境保護部在2017 年8 月發布《關于汞的水俁公約》生效的公告，公告事項包括2032年8月起全面禁止原生汞礦開采［5］，藥用朱砂面臨資源短缺的危機。合成朱砂能否作為天然朱砂的替代品，兩者藥效和毒性有無差異目前未見相關報道。筆者采用水合氯醛閾上催眠試驗及小鼠急性毒性試驗，比較兩種朱砂的藥效及毒性差異，以期為朱砂的臨床應用提供依據。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器與試劑

電子分析天平（美國奧豪斯公司，型號：CAV－64C）；臺式離心機（德國Sigma 公司，型號：3－16PK）；超純水機（美國Millipore 公司，型號：Spring－R10）；高速冷凍離心機（美國Thermo公司，型號：ST8R）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CX31）。

水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150508）；0.9% 生理鹽水（辰欣藥業，批號：1711112703）；地西泮（山東信誼制藥有限公司，批號：H37023039）；4%多聚甲醛（Biosharp，批號：BL539A）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170810）。

天然朱砂［保和堂（亳州）制藥有限公司/湖南鳳凰，批號：20210311］；合成朱砂［保和堂（亳州）制藥有限公司/貴州萬山，批號：20210311］。經江蘇省食品藥品檢驗研究員胡皓彬主任中藥師鑒定為硫化物類礦物辰砂族辰砂及合成朱砂。采用2020 版《中華人民共和國藥典》一部中朱砂含量測定項HgS含量測定方法，測定兩種朱砂HgS含量，分別為98.57%、99.58%，符合規定。

1.2 實驗動物

催眠實驗使用SPF 級ICR 雄性小鼠36 只，體質量18～20 g。急性毒性實驗使用SPF 級ICR 小鼠30 只，體質量18～20 g，雌雄各半。購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司，合格證編號：SCXK（蘇）2018－0049。實驗動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，濕度45%～55%，室溫22～25 ℃，12 h 明暗交替，自由飲水進食。

2 方法

2.1 朱砂的水飛炮制

朱砂藥材參考2020 版《中華人民共和國藥典》方法，將天然朱砂和合成朱砂凈制，稱取適量置于乳缽內，加5 倍量水研磨至糊狀，加1∶50 倍水攪拌，停留6 min，傾出混懸液，下沉的粗粉繼續研磨，每次研磨30 min。如此反復4 次以上，直至手捻細膩，無亮星為止，棄去雜質，合并傾出的混懸液靜置8 h以上，傾去上清液，取沉淀置40～60 ℃干燥，研散后過九號篩。

2.2 水合氯醛閾上催眠實驗

雄性小鼠36 只，按體質量隨機分為6 組，每組6 只，分別為空白組（KB）、陽性藥組（Y）、天然朱砂低劑量（TD）、天然朱砂高劑量組（TG）、合成朱砂低劑量組（RD）、合成朱砂高劑量組（RG）。按照臨床劑量計算，天然朱砂和合成朱砂高、低劑量組給藥劑量分別為83.33、16.67 mg/kg；空白組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；陽性藥組給予2.5 mg/kg地西泮。各組均每日給藥1 次，連續給藥7 d。最后一次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥30 min 后腹腔注射0.38 mg/g 水合氯醛溶液［6］。比較各組藥物對小鼠睡眠潛伏期（腹腔注射后到翻正反應消失的時間）和睡眠時長（小鼠翻正反射消失到重新恢復的時長）的影響。

2.3 急性毒性實驗研究

2.3.1 最大受試藥物量實驗

參考《中藥、天然藥急性毒性研究技術指導原則》，實驗給藥前小鼠禁食12 h，不禁水，將朱砂樣品以0.5%的羧甲基纖維素鈉助懸，配置成混懸液，濃度為0.6 g/mL（可均勻混淆的最大濃度）。

將小鼠按性別、體質量隨機分成空白組、天然朱砂組和合成朱砂組，每組10 只，雌雄分籠飼養。實驗前12 h禁食不禁水，給藥組每只小鼠按照給藥量為48 g/kg（按照體表面積折算約為60 kg 人臨床推薦日劑量的600倍），以灌胃量為20 mL/kg進行灌胃給藥，分2次給藥；對照組給予等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。給藥后24 h內觀察小鼠生理狀態，包括小鼠精神狀態、活動變化、進食情況及小鼠死亡只數。若發現小鼠死亡，則立刻解剖小鼠觀察臟器的病理變化。若小鼠無死亡，則正常喂養，連續觀察14 d，每隔兩天測定小鼠體質量及攝食量，實驗結束后，將小鼠脫頸處死，取肝、脾、腎，觀察是否有肉眼可見的病理變化，再用生理鹽水沖洗，用濾紙吸干后稱重，計算臟器系數［2］。

臟器系數（%）=小鼠臟器重量/體質量×100%

2.3.2 病理學檢查

每組隨機抽取5 只小鼠的肝、腎組織，用4%多聚甲醛固定，通過蘇木精－伊紅（HE）的組織染色評估各組織病理病變情況。

2.4 統計學方法

采用SPSS25.0 統計軟件對數據進行統計分析，以獨立樣本t檢驗進行顯著性差異比較，結果以（±s）表示。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠時長比較

與空白組比較，陽性藥組能極顯著延長小鼠睡眠時長（P＜ 0.01），天然朱砂與合成朱砂高、低劑量組均能顯著延長水合氯醛催眠小鼠的睡眠時長（P＜0.05），兩種朱砂藥效沒有顯著差異，相同劑量的兩種朱砂催眠作用也沒有顯著性差異。陽性藥組能顯著縮短小鼠睡眠潛伏期（P＜ 0.01），不同劑量的兩種朱砂均無法縮短小鼠睡眠潛伏期。結果見表1和圖1～2。

圖1 各組小鼠睡眠時長比較

圖2 各組小鼠睡眠潛伏期比較

表1 各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠時長的比較（±s）

表1 各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠時長的比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

睡眠時長/min 91.36 ± 7.53 300.75 ± 31.46**127.61 ± 11.09*133.84 ± 16.80*123.78 ± 13.07*134.86 ± 13.34*組別空白組陽性藥組天然朱砂低劑量組合成朱砂低劑量組天然朱砂高劑量組合成朱砂高劑量組n6 6 6 6 6 6劑量/（mg/kg）—2.50 16.67 16.67 83.33 83.33睡眠潛伏期/min 4.44 ± 1.16 2.78 ± 0.67*4.28 ± 0.91 4.43 ± 0.86 4.56 ± 1.68 5.23 ± 1.96

3.2 急性毒性實驗結果比較

3.2.1 小鼠生存狀態觀察

小鼠給藥1 h 以內，小鼠活動次數減少，待1 h 之后，小鼠外觀和精神狀態正常，飼養兩周內，給藥組小鼠與空白組小鼠比較，排泄正常，攝食正常，無小鼠死亡。一般情況、行為、活動、糞便、皮毛均未見異常，所有動物均存活，動物未出現呼吸抑制、驚厥、抽搐等反應。朱砂組體質量與對照組無顯著差異，大體解剖未見臟器異常病變。

3.2.2 最大受試藥物量實驗給藥后小鼠體質量變化情況比較

各組小鼠給藥均未出現死亡現象，與空白組比較，小鼠給藥后體質量差異無統計學意義，表明兩種朱砂并未影響小鼠體質量增長，也無小鼠急性中毒現象。結果見表2和圖3。

圖3 最大受試藥物量實驗給藥后小鼠體質量變化情況比較

表2 最大受試藥物量實驗給藥后各組小鼠體質量變化情況比較（±s，g）

表2 最大受試藥物量實驗給藥后各組小鼠體質量變化情況比較（±s，g）

組別空白組天然朱砂組合成朱砂組n 10 10 10第1天20.15 ± 1.23 21.06 ± 3.89 20.91 ± 2.02第3天21.74 ± 3.33 22.70 ± 1.23 22.69 ± 2.38第5天23.14 ± 1.56 24.48 ± 1.29 24.41 ± 5.84第7天26.63 ± 2.14 25.57 ± 2.60 26.63 ± 2.90第9天27.14 ± 5.21 27.41 ± 1.49 27.45 ± 3.24第11天28.49 ± 3.07 29.33 ± 3.50 30.40 ± 2.97第13天31.89 ± 2.37 31.47 ± 5.60 33.30 ± 2.57第14天30.76 ± 5.33 30.63 ± 4.31 32.32 ± 3.41

3.2.3 最大受試藥物量實驗給藥后小鼠臟器指數比較

與空白組比較，各給藥組小鼠臟器指數差異無統計學意義，表明兩種朱砂在600 倍臨床給藥劑量下無急性毒性。結果見表3，圖4。

圖4 最大受試藥物量實驗給藥后各組小鼠臟器指數比較

表3 最大受試藥物量實驗給藥后各組小鼠臟器指數情況比較（±s，%）

表3 最大受試藥物量實驗給藥后各組小鼠臟器指數情況比較（±s，%）

組別空白組天然朱砂組合成朱砂組n 10 10 10肝臟指數3.934 ± 0.178 3.806 ± 0.033 4.055 ± 0.195腎臟指數1.375 ± 0.090 1.341 ± 0.073 1.368 ± 0.086脾臟指數0.221 ± 0.012 0.229 ± 0.016 0.222 ± 0.024

3.2.4 最大受試藥物量實驗給藥后小鼠臟器組織病理學結果比較

空白組、天然朱砂組及合成朱砂組小鼠肝、腎、脾臟器組織細胞排列整齊，無異常病理改變，肝小葉結構清晰，肝細胞無變性壞死現象；腎小球結構清晰，腎小管結構無顯著病變壞死；脾小體結構清晰，可見中央動脈，白髓、紅髓邊界較為清晰。可見，臨床最大給藥劑量的600 倍下，天然朱砂及合成朱砂均不會引起小鼠急性毒性反應，兩者均無急性毒性。結果見圖5～7。

圖5 各組小鼠肝組織病理切片（HE，× 200）

圖6 各組小鼠脾組織病理切片（HE，× 200）

圖7 各組小鼠腎組織病理切片（HE，× 200）

4 討論

朱砂是臨床常用安神藥［7］。《中華人民共和國藥典》收載朱砂來源為硫化物類礦物辰砂族辰砂，但市場流通大量合成朱砂。我國制備人工合成朱砂的歷史久遠，古籍中早有記載，并將其分為靈砂和銀朱兩種［3］。靈砂始載于《證類本草》，曰：“用水銀一兩，硫黃六銖，細研，先炒作育砂頭，后入水火既濟爐，抽之如束針紋者，成就也”；《本草綱目》載：“升靈砂法，用新鍋安逍遙爐上，密揩鍋底，文火下燒，入硫黃二兩熔化，投水銀半斤，以鐵匙急攪，作青砂頭。如有焰起，噴醋解之。待汞不見星，取出細研，盛水火鼎內，鹽泥固封，下以自然火升之，干水十二盞為度，取出如針束者成矣”［3，8-9］。銀朱首見李時珍引胡演《丹藥秘訣》曰：“升煉銀朱，用石亭脂二斤，新鍋內熔化，次下水銀一斤，炒作青砂頭，炒不見星。研末罐盛，石版蓋住，鐵線縛定，鹽泥固濟，大火鍛之。待冷取出，貼罐者為銀朱，貼口者為丹砂”［3，8］。靈砂升煉火力緩和，燒的時間長，質量較純。銀朱可能含有一定量的硒、砷、游離汞、單質硫等物質，純度相對低［3］。通過本草考證和文獻查閱，研究認為朱砂、靈砂、銀朱不是同一中藥，且在病癥、用法及用量上應對三種藥材進行使用范疇規定［10］。古籍中對三種藥材的基原、性味歸經、功效總結見表4。

表4 朱砂、靈砂、銀朱基原、性味歸經、功效對比

市場流通主要是靈砂即水銀和硫黃合成的合成品。但目前尚未見系統評價天然朱砂和合成朱砂藥效或毒性差異的研究。

筆者通過觀察腹腔注射水合氯醛閾后小鼠的睡眠潛伏期、睡眠時長等，比較天然朱砂與合成朱砂鎮靜催眠活性。結果表明，不同劑量下兩種朱砂均可顯著延長水合氯醛誘導的小鼠睡眠時長，相同劑量天然朱砂和合成朱砂之間比較差異無統計學意義，即天然朱砂與合成朱砂明均具有催眠作用，且兩者藥效無顯著性差異。查閱歷代版本《中華人民共和國藥典》發現，朱砂臨床使用最大劑量曾大幅度降低，為了保證朱砂臨床應用的安全性，1995版《中華人民共和國藥典》以后，朱砂臨床應用劑量由每天0.3～1.5 g（1977、1985、1990年版）下降為0.1～0.5 g，并一直沿用至今，因此本研究中高低劑量給藥組對水合氯醛催眠小鼠的睡眠時長無劑量差異，可能是由于朱砂最高臨床用藥劑量的降低引起的血藥濃度降低，從而導致劑量依賴性不明顯。

本研究采用最大受試藥物量實驗一次性灌胃臨床用藥600倍最大劑量（48 g/kg）條件下的朱砂的急性毒性作用，發現兩種朱砂均對小鼠無急性毒性作用，小鼠體質量、小鼠臟器指數與空白組比較差異無統計學意義，肝、腎、脾等臟器指數無顯著性差異，且解剖時各臟器未發現明顯病理變化，組織病理學檢查顯示兩者對各臟器均未產生明顯毒性。Hg2＋是朱砂中主要毒性物質［11-12］，本研究急性毒性實驗結果顯示，兩種朱砂均無明顯急性毒性，這可能與朱砂水飛過程中大量水處理將可溶性毒性物質溶出，朱砂中毒性成分含量顯著降低有關。

5 結論

本文研究表明，天然朱砂與合成朱砂均具有催眠作用，且藥效無顯著性差異，兩種朱砂均無明顯急性毒性作用。