基于PI3K/Akt信號通路探究下調miR-221對肝癌大鼠的干預效果

代宇 范偉

(貴州省人民醫院肝膽外科,貴州 貴陽 550002)

肝癌的發生與缺乏微量元素、肝硬化、生活環境、吸煙、遺傳等因素存在聯系,其早期臨床癥狀表現為刺痛、腹瀉、腹水、食欲減退、肝大、惡性等。目前臨床多通過免疫治療、抗病毒治療、局部消融、手術等方法對肝癌進行治療,但其復發率仍較高,因此尋找新的治療策略對肝癌患者預后具有重要意義〔1～6〕。miR-221在宮頸癌、喉癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達,可參與腫瘤的發生、發展〔7〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)在鼻咽癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌等多種腫瘤中發揮抗凋亡、促增殖的作用〔8〕。基于此,本文基于PI3K/Akt信號通路探究下調miR-221對肝癌大鼠的干預效果,為肝癌的診治提供參考。

1 對象與方法

1.1研究動物 選取43只SPF級Wistar大鼠,體質量160～200 g,由珠海市麗珠單抗生物技術有限公司提供,動物許可證號：SYXK(粵)2021-0158,所有大鼠在室溫23 ℃、濕度50%的無菌籠子中喂養7 d,本試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規定,且經醫院倫理委員會批準同意。

1.2miR-221慢病毒載體構建 采用GenBanK查找序列,獲得脂蛋白脂肪酶(LPL)基因序列,構建miR-221沉默、過表達轉染質粒,由長沙愛科博生物科技有限公司設計并合成,并設置病毒滴度為1×109TU/ml,測定慢病毒滴度。

1.3分組與建模 選取10只大鼠作為空白組,其余33只參照王軍等〔9〕建立模型,將0.5 ml/100 g的二乙基亞硝胺注射入大鼠腹腔內,2次/w,連續注射4 w,以大鼠出現精神萎靡、被毛蓬松污穢、眼睛無神、拱背等情況為建模成功,最終有30只建模成功,分為模型組、上調組、下調組各10只。

1.4miR-221轉染 上調組、下調組分別注射10 μl miR-221過表達、沉默慢病毒懸液,空白組、模型組注射同劑量的生理鹽水,注射7 d后觀察大鼠變化。

1.5病理學觀察 miR-221轉染后,麻醉后處死大鼠,獲取肝臟組織,進行脫水、石蠟包埋處理,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下,對病理形態進行觀察。

1.6miR-221轉染效率鑒定 實時熒光定量法鑒定miR-221轉染效率,提取肝臟組織總RNA,采用聚合酶鏈反應(PCR)法鑒定miR-221表達量,使用Primer5.0設計引物序列,反應體系：20 μl蒸餾水,模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物。反應條件：95 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、50 ℃ 2 min,60 ℃ 30 s,共進行45個循環,采用2-△△Ct方法計算出miR-221的表達量。

1.7生長因子、血清癌胚抗原(CEA)、血清甲胎蛋白(AFP)水平檢測 取各組大鼠肝臟組織,放入離心管,將放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、蛋白酶抑制劑加入,以12 000 r/min離心處理10 min,制作組織勻漿,取上層清液,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血管內皮生長因子(VEGF)、bFGF、CEA、AFP水平,將VEGF、bFGF、CEA、AFP標準品稀釋,倒入EP管,后加入待測標準品,混勻,后將其倒入空白孔中,室溫下孵育90 min,在孔中加入洗滌緩沖液,重復清洗,后加入50 μl VEGF、bFGF、CEA、AFP抗體,室溫下孵育60 min,加入洗滌緩沖液,重復清洗,加入100 μl SP結合液,封孔,室溫下孵育45 min,加入洗滌緩沖液,重復清洗,后加入100 μl 3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)顯色液,450 nm、570 nm下測定吸光度(OD)值。

1.8PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達量檢測 采用Western印跡法檢測,將各組大鼠肝臟組織放入離心管,將RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑加入,以12 000 r/min離心處理10 min,制作組織勻漿,取上層清液,使用蛋白質定量法對蛋白濃度測定,后取相同質量蛋白,進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜處理,后采用5%脫脂奶粉進行封管處理,放入4 ℃冰箱中,過夜處理,后進行清洗。加入PI3K、Akt抗體,孵育2 h,進行清洗,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗,室溫下孵育3 h,凝膠成像系統下觀察成像情況,計算恢復值,以GAPDH為內參,對蛋白表達情況分析。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行配對t檢驗及F檢驗。

2 結 果

2.1病理學特征比較 如圖1所示,空白組肝細胞無核分裂、細胞完整、大小一致;模型組出現炎性細胞浸潤,部分肝細胞壞死;上調組炎性細胞浸潤嚴重,細胞核出現增大;下調組炎性浸潤情況明顯改善,細胞大小基本恢復一致。

圖1 各組肝臟組織病理特征(HE染色,×400)

2.2miR-221轉染效率鑒定 如表1所示,與空白組相比,模型組、下調組、上調組miR-221表達量上升,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組miR-221表達量上升,下調組miR-221表達量下降,具有統計學差異(P<0.05),說明轉染成功。

表1 各組miR-221轉染效率、生長因子、腫瘤標志物水平及肝臟組織PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達量比較

2.3各組生長因子水平對比 如表1所示,與空白相比,模型組、上調組、下調組VEGF、bFGF水平上升,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組VEGF、bFGF水平上升,下調組VEGF、bFGF水平下降,具有統計學差異(P<0.05)。

2.4各組腫瘤標志物水平對比 如表1所示,與空白相比,模型組、上調組、下調組CEA、AFP水平上升,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組CEA、AFP水平上升,下調組CEA、AFP水平下降,具有統計學差異(P<0.05)。

2.5各組肝臟組織PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達量 如表1、圖2所示,與空白相比,模型組、上調組、下調組PI3K、Akt水平上升,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組PI3K、Akt水平上升,下調組PI3K、Akt水平下降,具有統計學差異(P<0.05)。

圖2 各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達

3 討 論

研究顯示〔10〕,miR-221可參與細胞增殖、發育、細胞凋亡、脂肪代謝、造血過程、病毒防御等過程,在宮頸癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達。在宮頸癌中,miR-221可提高HeLa細胞的增殖能力,且可使癌細胞凋亡減少;在甲狀腺癌中,miR-221可促進淋巴結轉移,進而促進了患者病情的發展〔11〕。焦文鵬等〔12〕研究發現,miR-221在肝癌中呈高表達,且與不良預后、腫瘤大小、臨床分期存在密切聯系。本研究顯示,下調miR-221后可干預肝癌大鼠病情的發展,大鼠炎性浸潤情況明顯改善,細胞大小基本恢復一致。其機制可能為miR-221可使肝癌上皮-間質轉化過程啟動,且可靶向脂聯素受體(AdipoR)1、植物同源結構域指蛋白(PHF)2,進而促進了肝癌細胞的激活及轉移,促進肝癌患者病情的發展,因此經下調miR-221干預后大鼠病情明顯改善〔13〕。

VEGF可通過改善瘤體邊緣細胞能量代謝、促進微血管形成、抑制細胞凋亡等促進腫瘤的發生、發展,而肝癌的主要典型特征為大量新生血管形成,因此VEGF在肝癌患者中多呈高表達〔14〕。bFGF作為一種單鏈多聚體,對多種細胞的有絲分裂具有促進作用,且對血管生成具有促進作用,可參與腫瘤間質血管新生、侵襲〔15〕。CEA多由位于泌尿道、胃、呼吸道等空腔臟器腫瘤分泌,在腫瘤狀態下,可進入血、淋巴循環,進而導致其水平快速升高〔16〕。AFP主要由肝細胞、卵黃囊合成,而部分肝外腫瘤、肝細胞癌、胚胎性腫瘤、卵黃囊腫瘤可重新合成AFP,進而導致AFP水平升高〔17〕。本研究表明,抑制miR-221表達,可使新生血管形成受到影響,且可促進CEA、AFP腫瘤標志物水平的優化。

PI3K/Akt是在肝癌、腎癌、膽管癌、喉癌中均呈異常表達的細胞內外信號連接橋梁〔18〕。Akt為PI3K/Akt通路重要環節,在磷酸化后可使PI3K/Akt信號通路激活,進而對下游相關基因、旁路信號分子起到了激活作用,調控了細胞遷移、侵襲、增殖、凋亡等過程,同時激活后的PI3K/Akt可促進VEGF、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2等因子的表達,進而促進了腫瘤血管的形成、腫瘤細胞的擴散、轉移,推動了腫瘤患者病情的發展〔19～21〕。本研究顯示,下調miR-221可明顯減少新生血管的形成,抑制病情發展,其可能作用機制為下調miR-221可抑制PI3K/Akt信號通路,作用于新生血管形成過程,進而改善了增生,最終抑制肝癌的發展。

綜上所述,肝癌的發生可激活PI3K/Akt通路,使機體內VEGF、bFGF、CEA、AFP表達水平升高,促進腫瘤血管的形成,加速疾病的發展,對大鼠機體內miR-221表達量進行抑制,可抑制PI3K/Akt通路的激活,促使大鼠的恢復,表明肝癌的發病機制可能與PI3K/Akt信號通路被抑制有關。