EZH2在前列腺癌中表達及其抑制劑對前列腺癌細胞生物行為學的影響

周擎宇 姜華茂

(錦州醫科大學附屬第一醫院泌尿外科,遼寧 錦州 121001)

前列腺癌屬于男性泌尿系統惡性腫瘤,其具有發病率高、起病隱匿等特點,治療方式主要為放化療,但其生存率較低,因此對前列腺癌的發生、發展機制進行探究對診斷及治療意義深遠〔1～7〕。zeste基因增強子同源物(EZH)2在癌癥中上調,與癌癥的發展關系密切,研究證實,EZH2在腫瘤患者中過表達表示預后較差,可促進乳腺癌、結腸癌等細胞增殖〔8,9〕。EZH2對腫瘤具有促進作用,因此對于EZH2抑制劑的研究不斷深入。EZHZ甲基轉移酶抑制劑(GSK126)屬于新型抑制劑,抑制EZH2功能,阻礙甲基化組蛋白H3(H3K27)甲基化,發揮抗腫瘤的效果〔10〕。EZH2在前列腺癌的進展中作用較為重要,但具體作用機制尚不清晰,基于上述研究背景,本研究對前列腺癌組織及細胞中EZH2進行檢測,并探討EZH2抑制劑干預前列腺癌細胞,對其增殖、凋亡的影響及可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 于2018年4月至2020年10月錦州醫科大學附屬第一醫院經病理學診斷確診為前列腺癌患者20例,并進行手術切除得到20例前列腺癌組織標本及20例癌旁組織標本;年齡42～65歲,平均年齡(52.64±6.97)歲。患者均知情,自愿參與,未接受過內分泌治療、放化療。

1.2儀器、試劑及細胞培養 將獲得的前列腺癌組織標本及癌旁組織標本放置于液氮中保存。前列腺正常細胞RWPE-1及前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145細胞系均購自中科院上海細胞所。主要儀器及試劑盒廠家：GSK126購自美國Selleck生物科技有限公司;噻唑藍(MTT)試劑購自北京博奧拓達科技有限公司;逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購于TaKaRa公司;流式細胞儀購自美國BD公司;B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)一抗、二抗均購自美國Santa Cruz,RPMI1640培養基購自Invitrogen公司。正常前列腺上皮RWPE-1細胞、前列腺癌PC-3、LNCaP和DU145細胞培養于RPMI1640培養基中,37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,融合度70%～80%,胰蛋白酶消化,傳代培養。

1.3細胞轉染 取對數生長期PC-3細胞,以1×105個/ml接種96孔培養板,隨機分為4組,分別為對照組、低、中、高劑量GSK126組,對照組細胞不做處理,低、中、高劑量GSK126組細胞分別應用EZH2抑制劑GSK126,溶解于DMSO,稀釋到所需終濃度5、25、50 μmol/L,溶于培養基中,細胞傳代、換液均加入GSK126,維持7 d后,取各組對數生長期細胞進行實驗。

1.4熒光定量PCR檢測 取癌組織、癌旁組織及轉染7 d的細胞,Trizol提取總RNA,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒檢測濃度、純度。獲取cDNA,根據試劑盒說明書進行擴增,反應條件：94 ℃變性30 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環;引物序列：EZH2上游引物5′-GTTGGCGGGA AGCGTGTAAAGACT-3′,下游5′-GTATCCTTCGCTGCTTCCATTC-3′,β-actin上游引物5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAG-3′,下游5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′,以β-actin為內參,2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.5細胞增殖 收集干預后各組PC-3細胞,調整細胞密度,1×105個/孔接種培養板,常規培養12、36、72 h后,收集細胞,5 g/L的MTT溶液20 μl,孵育4 h,棄上清,加二甲基亞砜200 μl,反應后,檢測各組吸光值(OD值),實驗重復3次。

1.6細胞凋亡 分別取轉染7 d后各組PC-3細胞,按照說明書進行步驟操作,流式細胞儀對各組細胞的凋亡情況進行檢測。實驗重復3次。

1.7Western印跡檢測蛋白相對表達 Western印跡檢測Bax、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR蛋白相對表達量,將各組細胞接種到6孔板,加入細胞裂解液,裂解細胞,收集上清液;BCA檢測蛋白濃度,30 μg蛋白樣品,進行電泳,室溫下孵育1 h,加入兔抗Bax、Caspase-3、Bcl-2、P13K、AKT、mTOR及GADPH多克隆抗體溶液4 ℃冰箱孵育過夜,第2天室溫孵育二抗,重復試驗3次,分析條帶灰度值。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行配對t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1EZH2在前列腺癌組織及前列腺癌細胞中的相對表達 前列腺癌組織EZH2的相對表達量較癌旁組織明顯升高(2.36±0.35 vs 1.02±0.03,t=17.060,P=0.001,n=20)。前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145細胞和前列腺上皮RWPE-1細胞中EZH2表量分別為2.39±0.31、1.87±0.12、2.03±0.16、1.05±0.04。與前列腺上皮RWPE-1細胞相比,前列腺癌細胞中EZH2的表達水平均上升,差異有統計學意義(F=20.340,P<0.001)。在3種前列腺癌細胞中,PC-3細胞中EZH2表達水平顯著高于LNCaP細胞(n=10,t=4.947,P<0.05)、DU145細胞(t=7.034,P<0.05)。后續研究采用PC-3細胞。

2.2不同劑量EZH2抑制劑GSK126對PC-3細胞增殖的影響 如表1所示,與對照組相比,低、中、高劑量GSK126組前列腺癌PC-3細胞中EZH2的相對表達水平均降低,中劑量GSK126組降低較其他兩組更為明顯,具有統計學差異(P<0.05)。可見應用EZH2抑制劑GSK126后,成功下調EZH2在PC-3細胞中的表達。轉染12、36和72 h后,與對照組相比,低、中、高劑量GSK126組OD值均升高,中劑量GSK126組降低較其他兩組更為明顯,具有統計學差異(P<0.05)。表明應用EZH2抑制劑GSK126后對PC-3細胞的增殖能力有明顯的抑制作用。

表1 不同劑量EZH2抑制劑GSK126對PC-3細胞增殖、凋亡的影響

2.3不同劑量EZH2抑制劑GSK126對PC-3細胞凋亡的影響 如表1、圖1、圖2所示,與對照組相比,低、中、高劑量GSK126組凋亡率及凋亡蛋白Bax、Caspase-3均升高,Bcl-2降低,中劑量GSK126組較其他兩組效果更為明顯,具有統計學差異(P<0.05)。表明應用EZH2抑制劑GSK126后可促進PC-3細胞凋亡。

圖1 各組PC-3細胞凋亡(Tunel染色,×200)

2.4PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白相對表達量 如表2所示,與對照組相比,低、中、高劑量GSK126組P13K、AKT、mTOR蛋白相對表達均較低,中劑量GSK126組降低較其他兩組效果更為明顯,具有統計學差異(P<0.05)。表明應用EZH2抑制劑GSK126后可抑制PC-3細胞PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白表達。

表2 各組PI3K-AKT-mTOR信號通路相關蛋白相對表達量

3 討 論

EZH2是屬于組蛋白甲基轉移酶,其在前列腺癌中可能是通過調控組蛋白甲基轉移酶活性介導轉錄抑制,與轉錄因子結合,高表達,促進細胞增殖〔11,12〕。EZH2在前列腺癌細胞中表達較高時,較多抑癌基因被抑制,提示EZH2屬于抑制因子,抑制轉錄〔13〕。本研究結果顯示,前列腺癌和細胞中EZH2均呈現高表達,經EZH2抑制劑GSK126干預后,細胞的增殖抑制,細胞凋亡增強,以中劑量效果較為顯著,EZH2抑制劑GSK126通過抑制EZH2表達,促進抑癌基因表達,進而減弱細胞增殖。

抗凋亡屬于腫瘤治療較為重要,研究認為細胞凋亡有兩條路徑：內源性及外源性凋亡途徑〔14〕。內源性凋亡中細胞色素C釋放較為重要,抗凋亡Bcl-2家族分子和促凋亡分子Bax之間的平衡失調。Bcl-2家族在內源凋亡途徑中,對線粒體依賴進行調節〔15〕。Bax是促凋亡因子,致線粒體膜電位降低,細胞色素釋放,細胞凋亡〔16〕。并且上述兩條路徑會激活Caspase-3。Caspase-3被認為是凋亡的執行者,活化后可誘導細胞凋亡〔17〕。Bax、Caspase-3在前列腺癌細胞中表達較低,Bcl-2表達較高,本研究表明,EZH2抑制劑GSK126可作為治療前列腺癌的潛在藥物靶點。

PI3K-AKT-mTOR通路參與細胞周期進程、通過AKT調控凋亡蛋白,從而抑制細胞凋亡,激活的PI3K-AKT-mTOR通路在前列腺癌的發生發展中作用較為重要〔18〕。研究表明,前列腺癌中PI3K-AKT-mTOR通路處于激活狀態,可促進腫瘤增殖,蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的突變可促進PI3K/Akt信號通路激活,調節下游mTOR蛋白,對細胞生長及功能進行調控〔19〕。研究顯示,EZH2表達與PI3K/AKT信號通路密切相關,對細胞增殖及周期具有一定的影響力〔20〕。本研究說明,EZH2抑制劑GSK126可抑制P13K-AKT-mTOR信號通路激活,但要注意劑量。mTOR蛋白及其下游相關蛋白表達可上調PI3K/AKT信號通路從而影響前列腺癌細胞的生物學行為,PI3K激活后,細胞增殖,EZH2調節AKT的磷酸化進而參與前列腺癌發生進展〔21〕。

綜上,EZH2抑制劑GSK126具有抑制結腸癌細胞中EZH2表達、細胞增殖及促進細胞凋亡作用,其作用機制可能與PI3K-AKT-mTOR信號通路有關,但僅為本文研究結果,EZH2抑制劑GSK126是否可通過其他信號通路途徑調節前列腺癌細胞EZH2表達及增殖凋亡并未分析,因此,后續仍需進一步驗證,充分挖掘EZH2抑制劑GSK126的醫用價值,為前列腺癌的研究提供新方向。