基于Caspase3探討余甘子葉提取物對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道高反應、肺泡上皮細胞活性的影響及作用機制

張愛軍 劉淵勇 于麗君 馮平

(1唐山市第三醫院,河北 唐山 063000;2河北北方第一附屬醫院)

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種以氣流受限為特征的進行性肺部疾病,其起病緩慢,病程較長,早期通常沒有自覺癥狀,隨病程的發展可出現慢性咳嗽、咳痰、氣短、胸悶等癥,這對患者的日生活質量造成了極大影響〔1〕。目前慢阻肺的確切病因尚不明確,但有研究表明,其與氣道炎癥密切相關,而氣道炎癥通常會引起氣道高反應,從而使氣道阻力增大,進而引發咳嗽、氣短、胸悶等癥狀,嚴重者可能會出現直接危及患者生命安全的寂靜肺,因此如何抑制氣道高反應已經成為目前醫學領域關注的焦點之一〔2〕。肺損傷在慢阻肺中極為常見,嚴重者可導致急性呼吸窘迫綜合征,甚至多器官衰竭,而有研究表明,慢阻肺肺損傷主要是由于炎性介質等所引起的肺泡上皮細胞凋亡,其可導致肺屏障損傷,從而出現肺泡出血、肺間質水腫及中性粒細胞浸潤增加等現象,進而導致肺部炎癥加重,最終促進疾病發生、發展,故如何改善肺泡上皮細胞活性是目前臨床工作的重點之一〔3〕。而胱天蛋白酶(Caspase)3是凋亡過程重要的執行者,是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路,其一旦被激活,蛋白酶級聯反應就會被啟動,從而放大凋亡信號通路,加速細胞凋亡,故其可能在慢阻肺的發生發展中扮演重要角色〔4〕。抗菌藥物是臨床慢阻肺最為常用的治療方式,但長期使用可能導致免疫力下降,最終甚至可能導致肺部感染〔5〕。研究表明,中藥在治療慢阻肺方面療效顯著,因此受到愈來愈多的研究人員關注〔6〕。余甘子葉是我國傳統中藥,其具有廣泛的藥理作用,可健胃消食、化痰止咳、保肝解毒、清熱生津,此外其在抗菌方面也發揮著重要作用,因此被廣泛應用于臨床治療中〔7〕。但其是否對慢阻肺具有治療作用尚不清楚,本文基于Caspase3探討余甘子葉提取物對慢阻肺大鼠氣道高反應及肺泡上皮細胞活性。

1 材料與方法

1.1動物材料 本實驗選取深圳華大基因股份有限公司提供的60只SPF級SD雄性大鼠,平均體質量170～210 g,室溫生長,模仿晝夜交替,在常溫下進行無菌飲食2 w,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2實驗材料 余甘子葉提取物(貨號：128,西安金綠有限公司);乙酰半胱氨酸顆粒(富露施,貨號：國藥準字H20030732,廣東百澳藥業有限公司);Caspase3抑制劑(Z-DEVD-FMK,貨號：HY-12466,MedChemExpress LLC);香煙發生器(型號：RC-200,上海玉研有限公司);脂多糖(貨號：FT031030,上海梵態有限公司);電子分析天平(型號：FA2004N,上海菁海有限公司);無創肺功能儀(型號：PLY,上海玉研有限公司)低溫冷凍離心機(型號：Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染液(貨號：BIR615,北京博爾西有限公司);光學顯微鏡(型號：TS2009,河南云飛有限公司);TUNEL試劑盒(貨號：ATK00001,武漢益普有限公司);免疫組化試劑盒(貨號：YDDEF001,上海羽哚有限公司);Caspase3抗體(貨號：PL0403200,深圳豪地華拓有限公司)。

1.3建模 50只SPF級SD雄性大鼠,使用專門的煙霧暴露裝置,將大鼠放置在閉合的空間內,暴露于煙霧中30 d,然后腹腔注射脂多糖10 mg/kg,6 h后大鼠出現明顯咳嗽、胸悶氣短、呼吸困難等癥狀,視為建模成功,均造模成功。

1.4分組及給藥 50只建模成功的大鼠中隨機分為模型(B)組、富露施(C)組、余甘子葉提取物(D)組、Caspase3抑制劑(E)組、余甘子葉提取物+Caspase3抑制劑(F)組,每組10只,同時隨機選取10只正常大鼠作為正常對照(A)組,C組灌胃50 g/kg富露施,D組灌胃50 mg/kg余甘子葉提取物,E組灌胃10 μg/kg Z-DEVD-FMK,F組給予余甘子葉提取物聯合Z-DEVD-FMK,兩組均1次/d,持28 d,A、B組同期灌胃同體積生理鹽水。

1.5大鼠氣道高反應檢測 建模完成后,對各組大鼠進行氣道高反應檢測,首先連接好無創肺功能儀并定標,然后將大鼠放到體積描記箱中,用Buxco系統測定大鼠氣道阻力,嚴格按照程序操作步驟,最后通過信號采集器采集數據并記錄。

1.6標本采集 氣道高反應實驗完成后,麻醉處死大鼠并稱重,然后取雙肺,電子天平稱重以計算肺體脂數(LBF),取大鼠右肺用干凈濾紙沾干右肺表面水分再次稱重,70 ℃烘箱烘干72 h稱重,用干濕重法測定肺含水量(LWC)。左肺組織固定48 h,常規石蠟包埋、切片,放入冰箱中密封保存。

1.7大鼠病理組織HE染色 取各組肺組織,流水沖洗,用無水乙醇浸泡5 min,95%的乙醇浸泡5 min,75%的乙醇浸泡5 min,蒸餾水洗滌2次,用蘇木素浸染15 min,蒸餾水沖洗30 min,用0.5%伊紅乙醇溶液染色3 min,蒸餾水洗滌后,脫水、透明、中性樹膠封片處理,光學顯微鏡觀察。

1.8TUNEL法檢測肺泡上皮細胞凋亡 取左肺組織切片浸入二甲苯中,脫去石蠟,將切片依次浸入絕對乙醇、95%乙醇、80%乙醇和去離子水中,每個液體中浸泡5 min,將切片放入蛋白酶K溶液中,浸泡10～20 min,用磷酸鹽緩沖液洗滌切片3次,每次約5 min,用TUNEL封閉液封閉切片,浸泡30 min,將切片轉移到TUNEL反應液中,37 ℃浸泡1 h,將切片洗滌3次,每次5 min,用去離子水洗滌1次,每次5 min。將切片放入染色劑4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色20 min至半小時,將切片放入去離子水中,輕輕晃動幾次,然后放在紙巾上吸干余液,將切片置于顯微鏡載玻片上,在切片上方放置一個小滴無氧溶劑并覆蓋玻片,使用共聚焦顯微鏡觀察切片。

1.9免疫組化法檢測Caspase3蛋白表達 取各組肺組織,用二甲苯進行兩次脫蠟,每次20 min,再用乙醇進行梯度浸泡水化,沖凈并擦干后用過氧化氫溫室孵育10 min,PBS沖洗3次,用檸檬酸鹽緩沖液進行微波熱修復,2%BSA封閉30 min,加入稀釋的Caspase3一抗(1∶200),4 ℃過夜后洗膜;加入稀釋的生物素標記的二抗(1∶200),37 ℃水浴30 min;洗膜后,用DAB進行顯色,PBS洗滌3次,蘇木素復染后中性樹膠封片,光學顯微鏡觀察,計算機病理圖像處理系統進行半定量測定。

1.10統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組氣道高反應 與A組比較,B組氣道阻力明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組氣道阻力明顯降低,且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組相比無明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組氣道阻力、LBF、LWC含量、凋亡率及肺組織caspase3蛋白表達比較

2.2各組LBF及LWC含量 與A組比較,B組LBF、LWC含量明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組LBF、LWC含量明顯降低(P<0.05),且D組比C組降低明顯(P<0.05),E組與D組無明顯差異(P>0.05),F組比E組降低更顯著(P<0.05),見表1。

2.3各組肺泡上皮細胞凋亡結果 與A組相比,B組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組細胞凋亡率明顯降低,且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組無明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組細胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.4各組肺組織Caspase3蛋白表達 與A組相比,B組肺組織Caspase3蛋白表達明顯升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E、F組肺組織Caspase3蛋白表達明顯降低(P<0.05),且D組比C組降低顯著(P<0.05),E組與D組無明顯差異(P>0.05),F組比E組降低顯著(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組Caspase3蛋白表達(免疫組化,×200)

2.5各組肺組織HE染色 A組支氣管、肺泡正常完整,間質均勻無充血,未見炎性細胞浸潤;B組支氣管上皮破壞程度減少,可見明顯水腫出血,肺間質明顯增厚,且有大量炎細胞浸潤;與B組比較,C、D、E、F組病理形態明顯改善,見圖3。

圖3 各組肺組織結構(HE染色,×200)

3 討 論

慢阻肺是在全球范圍內非常常見,是導致死亡和殘疾的主要原因之一,根據世界衛生組織的數據,全球有超過3億人患病,每年因其死亡人數約為300萬人,故及早發現和治療至關重要〔8〕。而近年來隨著中醫治療不斷更新和發展,中醫治療慢阻肺在臨床上也取得了良好效果成為當今醫學領域的研究熱點〔9〕。

本研究說明,余甘子葉提取物可顯著改善慢阻肺大鼠氣道高反應。富露施是臨床上治療慢阻肺等由濃稠黏液分泌物過多導致的呼吸道疾病的常用藥物,其主要成分為N-乙酰半胱氨酸,其在化痰、抗氧化等方面發揮著重要作用,因此本文選其作為對照組〔10〕。余甘子葉是重要的傳統民族藥,已被載入多版《中國藥典》,其主治感冒發熱、咳嗽、咽喉痛、白喉、煩熱口干、消化不良等癥,且有研究表明,余甘子葉在體內外具有廣泛的抗菌作用,故近年來廣受中醫藥學者所關注〔11〕。氣道高反應是氣管、支氣管的一種異常敏感狀態,通常是由進入氣道的一些物質或反應原刺激所引起,其極易引發各種呼吸系統并發癥,從而導致氣道阻塞 、肺功能急劇下降〔12〕。而包括慢阻肺在內的很多臨床疾病都會表現出氣道反應性增高,這使黏液不但大量產生和分泌,還較難被清除,從而導致氣道狹窄,氣流受限,進而引發肺實質破壞,加重期引起血管壁增厚,最終可能會引發肺心病、心力衰竭等疾病,因此有效改善氣道高反應對提高患者生活質量具有深遠意義〔13〕。對于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過抑制支氣管平滑肌收縮反應,來抑制支氣管痙攣、氣道分泌物增加,從而有效抑制炎癥細胞從血管內釋放、聚集,抑制氣道重塑、抑制氧自由基的合成,進而抑制炎癥反應、抑制氧化應激,達到改善氣道損傷的目的,最終有效治療疾病。陳安〔14〕研究顯示,余甘子合劑對慢阻肺急性加重期患者具有顯著療效,可明顯改善其臨床癥狀體征、肺功能及氧化應激,這與本文結果類似。

本研究發現,余甘子葉提取物可以有效改善慢阻肺大鼠的肺損傷狀況。研究發現,慢阻肺與肺部損傷密切相關,長期吸入煙草煙霧和其他有害氣體和顆粒物會引起氣道和肺組織的損傷和炎癥反應,這些損傷和炎癥會導致氣道壁增厚、氣道黏液分泌增多、氣道平滑肌收縮、肺組織纖維化等,最終導致氣道狹窄和氣體交換障礙,因此如何抑制炎癥反應,改善肺損傷情況在治療慢阻肺方面尤為重要〔15〕。而當肺受到損傷時,肺部炎癥可以使肺組織中的毛細血管壁變得通透性增加,使液體從血液中滲出到肺泡和間質空間,導致肺水含量的增加,肺水含量的增加會導致肺部功能的損害和呼吸困難,故及時識別和處理肺水積聚是重要的管理措施之一〔16〕。對于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過抑制相關炎癥因子及信號通路,來抑制應激的產生,從而抑制炎癥滲出、減少損傷、并降低微血管通透性,進而使液體平衡恢復、減輕炎細胞浸潤現象,最終達到改善疾病的目的。王文迪等〔17〕研究顯示,對于煙霧吸入所致急性肺損傷大鼠,N-乙酰半胱氨酸具有顯著療效,可有效減輕其肺損傷,并減輕大鼠肺水腫及炎癥反應,這與本文結果類似。

本研究說明,余甘子葉提取物可有效改善慢阻肺大鼠肺泡上皮細胞活性,抑制Caspase3表達。研究發現,肺泡上皮細胞和肺損傷與之間存在著重要的關系,其活性的改變是肺損傷發生、發展的主要因素〔18〕。凋亡是一種正常的細胞死亡過程,通過這種方式細胞可以主動地從組織中被清除,而不會引起炎癥反應,但在肺損傷或疾病發生時,肺泡上皮細胞凋亡可能會增加,凋亡的調節失衡可能導致細胞死亡和炎癥反應的進一步加重,從而使慢阻肺癥狀加重,故其變化是反映肺泡上皮細胞活性的有效指標〔19〕。Caspase3參與調控和執行細胞凋亡程序,其激活后可進一步激活其他Caspase酶,形成一個級聯的酶活動網絡,最終導致細胞的凋亡,故Caspase3的活性調節對于維持正常的細胞生存和細胞凋亡的平衡至關重要〔20〕。而對于慢阻肺大鼠,余甘子葉提取物可能是通過抑制其上游信號通路的激活,來抑制Caspase3的轉錄及翻譯,從而抑制半胱氨酸蛋白酶類的級聯激活、抑制炎性細胞聚集與活化,進而抑制神經氨酸酶、細胞色素c、促凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用細胞凋亡促進因子(Bak)等的相互作用、抑制細胞凋亡等相關因子的產生,最終達到抑制細胞凋亡,有效改善疾病的目的。趙朝華等〔21〕研究發現,Caspase3在慢阻肺中表達顯著上升,給予阿奇霉素治療后,可改善大鼠肺組織形態和纖維化并抑制其氧化應激及Caspase3表達,這與本文結果類似。

綜上,余甘子葉提取物可有效改善慢阻肺大鼠氣道高反應及肺泡上皮細活性,其作用機制可能與抑制Caspase3表達有關。