胃泌素調控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響

崔光銳 楊維忠 邱堅 林文會

(海南醫學院第二附屬醫院消化內鏡科,海南 海口 570311)

胃癌是一種臨床上較為常見的惡性腫瘤,具有較高的致死率,位居所有惡性腫瘤死亡率第二位,嚴重威脅者患者的生命健康,也給個人及家庭帶來嚴重的經濟負擔〔1〕。研究表明,胃癌的發生和發展與異常表達的胃腸道激素有著密切的關系,而胃泌素就是一種胃腸道激素〔2〕。胃泌素由胃竇部G細胞產生的胃腸肽激素,主要作用是促進胃酸分泌及保護胃黏膜,同時發現胃泌素在胃癌發生及發展的過程中有著重要的作用〔3〕。研究發現〔4〕,胃泌素是一種促生長因子,胃腸的腫瘤細胞可以產生胃泌素,具有促進腫瘤細胞增殖和分化的作用,出現淋巴轉移的胃癌患者胃泌素的表達量明顯高于原發胃癌組織,推測胃泌素與胃癌細胞的侵襲及轉移密切相關。Wnt/β-catenin通路與多種人類癌癥發展密切相關,能參與癌細胞生長分化、遷移和侵襲等過程影響癌癥進展〔5〕。本文探討胃泌素調控Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞MKN45購自成都埃法生物科技有限公司;DMEM培養基購自Sigma公司;人胃泌素、丙谷胺、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購自上海碧云天生物技術有限公司;噻唑藍(MTT)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)總蛋白檢測試劑盒、Transwell小室購自武漢博士德生物工程有限公司;一抗、二抗購自美國Hyclone公司;c-myc抗體、Wnt3a抗體、β-catenin抗體購自北京博奧森公司;電泳儀、酶標儀購自Thermo公司。

1.2細胞培養及分組 將人胃癌細胞MKN45放置含有10%胎牛血清的DMEM培養基內,置于37 ℃、5%CO2培養箱內孵育,傳代培養時,加入胰酶消化培養,每2 d換1次培養液培養。取對數生長期細胞,以1×105/孔接種于6孔板中,將細胞分為對照組(不進行任何藥物處理)、胃泌素組(12.50 mg)、丙谷胺組(16.00 mg/L)及胃泌素聯合丙谷胺組(12.50 mg/L胃泌素與16.00 mg/L丙谷胺),每組8株人胃癌細胞MKN45。

1.3檢測人胃癌細胞MKN45增殖能力 每組細胞接種在96孔培養板內,用不同條件處理24 h后在每個培養孔內加入20 μl MTT試劑盒檢測液,在培養箱中繼續培養4 h,取出培養板并震蕩,而后在酶標儀上讀取450 nm波長處的吸光值。

1.4檢測人胃癌細胞MKN45遷移能力 各組MKN45細胞以胰酶消化,鋪板6孔板,待細胞貼壁后呈單層匯合時,使用無菌槍頭做劃痕,觀察并記錄劃痕距離,繼續培養24 h后,再次觀察并記錄劃痕寬度。

1.5檢測人胃癌細胞MKN45侵襲能力 各組MKN45細胞以無血清培養液洗滌并調整密度為1×105個/ml,上室添加100 μl細胞懸液,下室添加含10%胎牛血清培養液500 μl,培養24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗小室,拭去上室膜的細胞,多聚甲醛固,結晶紫染色,計數穿膜至小室的細胞數。

1.6檢測人胃癌細胞MKN45凋亡率 密度為1×106個/ml細胞接種到細胞培養皿中,培養48 h后,離心收集細胞,添加膜聯蛋白(Annexin)-Ⅴ、碘化丙啶(PI)染液,室溫下避光孵育15 min。通過30 μm篩網過濾單個細胞,Annexin-Ⅴ和PI雙重染色壞死細胞,Annexin-Ⅴ染色凋亡細胞,置于流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.7Western印跡法檢測相關通路蛋白表達水平 培養24 h后細胞進行裂解并制備成電泳上樣液,BCA法檢測上樣液濃度后計算具體上樣量,電泳后轉膜,經封閉、洗膜后,孵育c-myc、Wnt3a、β-catenin一抗(均1∶1 000稀釋)過夜,次日經洗膜后常溫下孵育二抗,時間為90 min,洗膜3次后用吸水紙吸干膜上多余液體,放入暗室內進行化學發光反應,應用ImageJ軟件進行分析。以β-actin為內參蛋白。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組人胃癌細胞MKN45增殖能力比較 與對照組相比,胃泌素組細胞增殖能力明顯升高,丙谷胺組細胞的增殖能力明顯降低,胃泌素聯合丙谷胺組細胞增殖能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯合丙谷胺組細胞增殖能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯合丙谷胺組細胞增殖能力明顯升高(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組人胃癌細胞MKN45增殖、遷移、侵襲、凋亡能力及相關通路蛋白表達比較

圖1 各組人胃癌細胞MKN45增殖能力(MTT,×200)

2.2各組人胃癌細胞MKN45遷移能力比較 與對照組相比,胃泌素組人胃癌細胞MKN45遷移能力明顯升高,丙谷胺組MKN45遷移能力明顯降低,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45遷移能力明顯升高(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組人胃癌細胞MKN45遷移能力(×200)

2.3各組人胃癌細胞MKN45侵襲能力比較 與對照組相比,胃泌素組人胃癌細胞MKN45侵襲能力明顯升高,丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯降低,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45侵襲能力明顯升高(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組人胃癌細胞MKN45侵襲能力(結晶紫染色,×200)

2.4各組人胃癌細胞MKN45凋亡能力比較 與對照組相比,胃泌素組人胃癌細胞MKN45凋亡能力明顯降低,丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯升高,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯降低(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯升高(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯合丙谷胺組MKN45凋亡能力明顯降低(P<0.05),見表1、圖4。

圖4 各組人胃癌細胞MKN45凋亡

2.5各組相關通路蛋白表達水平比較 與對照組相比,胃泌素組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平明顯升高,丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平明顯降低,胃泌素聯合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與胃泌素組相比,丙谷胺組、胃泌素聯合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);與丙谷胺組相比,胃泌素聯合丙谷胺組c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),見表1、圖5。

3 討 論

隨著人們不良的作息和飲食習慣,目前胃癌的發生率都在逐年升高,同時死亡率也在逐年升高〔6〕。在中國胃癌屬于高發國家,每年患有胃癌的人數占全球的40%左右〔7〕。通常發生胃癌原發腫瘤的死亡人數比較小,僅占10%,大多數患者主要死于胃癌的侵襲及遠處轉移,尤其是肝轉移〔8〕。而胃癌細胞增殖、侵襲及轉移是胃癌主要的病理學特征,由于這個病理學特征,使得胃癌在醫學上的治療比較困難,同時也會使患者的預后不佳〔9〕。

研究發現,胃癌的發生及發展與胃泌素有著密切的關系,同時已有研究證實,胃泌素可以促進細胞的增殖、侵襲及轉移,可以將胃泌素作為臨床診斷早期胃癌的標志〔10,11〕。有學者研究發現,胃癌組織中胃泌素的表達含量明顯高于其鄰近正常組織,胃泌素的上調與胃癌的發生機制有著密切的關系〔12〕。胃泌素的主要作用機制促進胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移,并抑制胃癌細胞凋亡,同時刺激胃癌細胞,導致產生腫瘤血管等〔13〕。本研究結果表明,胃泌素促進胃癌細胞增殖,丙谷胺阻滯胃泌素對胃癌細胞的增殖作用,這與劉駿〔14〕等研究結果相符合。本研究結果表明,胃泌素可以增強胃癌細胞的侵襲、轉移能力,降低其凋亡能力,丙谷胺可以降低胃癌細胞的侵襲、轉移能力,增強其凋亡能力。此外,說明丙谷胺可拮抗胃泌素促進的胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力,這與王斌峰等〔15〕研究結果相符合。

Wnt/β-catenin信號傳導途徑是一類傳導生長刺激信號的通路,由細胞外的Wnt3a蛋白及胞質內的β-catenin及下游的轉錄因子組成〔16〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白,c-myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點〔17〕。wnt/p-catenin也被稱為經典的Wnt信號通路,該通路主要通過β-catenin的核易位,激活下游IE基因的轉錄〔18〕。一些激素或因子激活了Wnt/β-catenin信號通路,導致某些復合物對β-catenin磷酸化產生抑制作用,β-catenin降解被減少,使β-catenin在細胞內聚積并向核內轉移〔19〕。胃泌素通過某些上調基因表促進胃癌細胞增殖、侵襲及遷移的能力,抑制其凋亡能力,表明Wnt/β-Catenin信號轉導通路可能是胃癌發生與轉移的關鍵通路〔20〕。本研究結果表明,胃泌素上調Wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-myc的表達,因此胃泌素對Wnt/β-catenin信號通路有一定的活化作用,而丙谷胺可以抑制胃泌素這一作用。

綜上,胃泌素通過Wnt/β-catenin信號通路上調c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平,并促進胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力,抑制其凋亡能力。