基于JNK-p62/SQSTM1信號通路探討糖腎煎對2型糖尿病腎病大鼠足細胞的保護作用

晏玲 胡愛民 張利芳 牛曉靜

(武漢市中醫醫院內分泌代謝病科,湖北 武漢 430014)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者一種常見的微血管并發癥,糖尿病患者中約有40%患有慢性腎臟疾病〔1〕。目前,DN已經發展成導致終末期腎病的一種重要因素,如果不能獲得及時治療,可能會造成腎衰竭等后果,嚴重威脅生命健康〔2〕。然而目前尚無DN的根治方法,主要采取控制血糖的手段來進行遏制〔3〕,但不能很好地阻止其發展。研究發現,足細胞在腎組織正常運行中發揮重要作用,足細胞損傷是導致DN產生的病理因素之一〔4〕。自噬對足細胞具有保護作用,如果自噬受到抑制,可能會引起足細胞足突、分離等損傷情況,在DN的發生發展中起到促進作用。然而機體長期處于高糖環境會抑制足細胞自噬〔5,6〕,因此想要解決DN,一方面需要降低血糖,另一方面還需要調控足細胞自噬,幫助其恢復正常自噬水平。細胞自噬受體蛋白p62是反映自噬活性的一個指標,其蛋白表達與自噬活性之間呈反比關系〔7〕。有研究發現,c-Jun氨基末端激酶(JNK)能夠通過介導p62/螯合體(SQSTM)1表達,來促進細胞自噬。糖腎煎是由黃芪、太子參、茯苓、生地等采用水煮醇提的方式制成的中藥提取物,臨床發現糖腎煎對2型DN有一定治療作用〔8〕,但作用機制尚未可知。本研究基于JNK-p62/SQSTM1信號通路探討糖腎煎對2型DN大鼠足細胞的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠36只(雌雄各半),體質量約250 g,8周齡,購于三峽大學,動物生產許可證號SCXK(E)2018-0007,動物使用許可證號：SYXK(E)2018-0104。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。本研究通過武漢市中醫醫院動物實驗倫理委員會的審批(倫理批號：20211026),符合動物倫理學標準。

1.2主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ,批號：20171027)購于美國Sigma公司;糖腎煎(生黃芪、太子參、山藥、丹皮、茯苓、五味子、山茱萸、赤芍、地黃、三七等,批號：20170927)由武漢市中醫醫院藥學部制備,采用“水煮醇提”法制成浸膏,臨用稀釋;二甲雙胍購于北京市永康藥業有限公司(批號：20190919,國藥準字H20080072);蘇木素-伊紅(HE)染色液(批號：20180803)購于上海吉至生化科技有限公司(AG1120);六胺銀(PASM)染色液(批號：20170916)購于上海茁彩生物科技有限公司;透射電鏡(TEM)制片處理試劑盒(批號：20180926)購于上海羽哚生物科技有限公司(YDJQ3605);兔抗微管相關蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3、兔抗p-JNK、兔抗JNK、兔抗p62/SQSTM1、兔抗腎病蛋白(Nephrin)、兔抗三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批號：20160219、20180326、20181110、20170427、20190512、20171021、20180218)均購于abcam公司。三諾GA-3型血糖儀(批號：20190625)購于上海聚慕公司;邁瑞Mindray全自動生化分析儀BS-280(批號：20180327)購于南京貝登醫療股份有限公司;日本奧林巴斯OlympusBX53-P偏光顯微鏡(批號：20181025)購于上海輔澤商貿有限公司;蔡司高速掃描電子顯微鏡MultiSEM(批號：20170620)購于昆山友碩新材料有限公司;Alpha View凝膠成像儀(批號：20190311)購于蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司。

1.3分組及DN模型構建 大鼠適應環境1 w后,開始進行DN模型構建。隨機選取6只大鼠作為正常組,每日給予正常飼料喂養。剩余大鼠隨機分為DN組、糖腎煎低、中、高劑量組(糖腎煎-L、M、H組)和二甲雙胍組,每組6只,給予高脂高糖飼料喂養。各組持續喂養4 w后,除正常組外,余下各組禁食不禁水4 h,一次性腹腔注射1% STZ(35 mg/kg),72 h后,進行空腹血糖(FBG)水平檢測,FBG≥16.7 mmol/L,可認為糖尿病模型構建成功〔9〕;繼續飼養1 w,收集24 h尿液,檢測尿蛋白含量,超過30 mg/24 h,表示DN模型成功。

1.4給藥 DN模型構建完成后,各組進行藥物處理。糖腎煎-L、M、H組分別灌胃糖腎煎生藥5、10、20 g/(kg·d)〔10〕,正常組和DN組灌胃等量生理鹽水,二甲雙胍組灌胃100 mg/(kg·d)二甲雙胍〔11〕。各組均每日上午灌胃1次,持續8 w。

1.5大鼠一般情況觀察 藥物處理結束后,觀察并記錄大鼠的毛發光澤度、精神狀況、活動情況、飲食及排尿量等。

1.6大鼠血生化指標FBG、負荷后2 h血糖(P2 h BG)、SCr、BUN水平檢測 末次給藥后,禁食12 h,麻醉后,使用血糖儀檢測大鼠FBG。收集腹部主動脈血液,用于檢測血清中血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平。大鼠灌胃40%葡萄糖水2 h后麻醉,收集腹部主動脈血液用于P2 h BG檢測。

1.7HE染色觀察大鼠腎組織病理變化 將大鼠脫頸處死,打開腹腔取出腎臟,一部分用于觀察組織病理學和超微結構,一部分-80 ℃凍存。將腎組織放入4%多聚甲醛中固定24 h后經乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋后制成石蠟切片,使用HE染色,放在光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.8PASM染色觀察大鼠腎組織病理變化 將4 μm左右腎組織石蠟切片脫蠟至水,使用高碘酸染色、烏洛托品儲備液孵育染色后顯微鏡下觀察,顯色反應以腎小球毛細血管基膜呈現黑色為基準,如果著色不夠,繼續孵育。接著使用硫代硫酸鈉進行處理,并復染伊紅、脫水、封片,最后放置在光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.9TEM觀察大鼠腎組織超微結構變化 腎組織制備成體積約1 mm3大小組織塊,放置在4 ℃環境中,使用戊二醇固定2 h,鋨酸固定1 h,接著制成60 nm左右薄片,經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色后,放置在TEM下觀察腎組織中足細胞和基底膜的超微結構。

1.10Western印跡檢測腎組織LC3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表達 取凍存腎組織,將其在液氮中打碎研磨后進行蛋白提取和濃度測定。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白、轉膜、加入0.5%脫脂奶粉封閉2 h,接著分別加入兔抗LC3、兔抗p-JNK、兔抗JNK、兔抗p62/SQSTM1、兔抗Nephrin、兔抗GAPDH(1∶1 000),4 ℃孵育過夜;之后加入山羊抗兔IgG(1∶5 000),室溫下孵育1 h,通過電化學發光法進行顯影,經ImageLab軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.11統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組一般情況 正常組毛發順滑有光澤,精神狀態良好,動作敏捷、飲食及排尿均正常。DN組毛發雜亂枯槁、精神萎靡,喜歡蜷縮在角落中倦怠懶動,行動遲緩,飲食量及排尿量均明顯增加。糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組與DN組比較,大鼠精神、動作、飲食及排尿量等均有所改善,其中糖腎煎-H組及二甲雙胍組改善較明顯。

2.2各組血生化指標FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平變化 DN組FBG、P2 h BG、SCr和BUN水平均明顯高于正常組(P<0.05)。與DN組比較,糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組FBG、P2 h BG、SCr水平明顯降低(P<0.05),糖腎煎-M、H組及二甲雙胍組BUN水平明顯降低(P<0.05),P2 h BG等水平的降低與糖腎煎劑量存在一定效應關系。與糖腎煎-H組比較,二甲雙胍組上述指標差異不明顯(P>0.05)。見表1。

表1 各組FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表達變化

2.3各組腎組織中LC3、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表達 DN組LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表達、p-JNK/JNK明顯低于正常組,p62/SQSTM1蛋白表達明顯高于正常組(P<0.05)。與DN組比較,糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表達、p-JNK/JNK明顯升高,p62/SQSTM1蛋白表達明顯降低(P<0.05),且糖腎煎對上述指標蛋白表達的作用效果具有劑量效應關系。與糖腎煎-H組比較,二甲雙胍組LC3-Ⅱ、Nephrin、p62/SQSTM1蛋白表達及p-JNK/JNK差異不明顯(P>0.05)。見表1、圖1。

1～6：正常組,DN組,糖腎煎-L、M、H組,二甲雙胍組圖1 各組LC3-Ⅱ、p-JNK1/2、JNK1/2、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表達

2.4各組腎組織病理變化 HE染色：顯微鏡下觀察可見,正常組腎小球大小正常、形狀完整、結構層次清晰,毛細血管腔規則,未觀察到有基質增生等情況。DN組腎小球縮小,局部有基質增生、增厚和不同程度基底膜增厚現象出現。糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組與DN組比較,基質增生、腎小球縮小等情況均獲得一定程度改善。PASM染色：腎小球Ⅳ膠原鍍銀呈現出黑色。DN組與正常組比較,觀察到腎小球管叢系膜明顯擴張,并有基底膜增生現象。糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組能夠不同程度減輕腎小球病理變化。見圖2。

圖2 各組腎組織病理(×400)

2.5各組腎組織足細胞變化 正常組毛細血管基底膜無增生等情況、形態正常,足細胞排列整齊,形態規則,足突無融合現象。DN組基底膜增厚,足細胞排列混亂,形態異常,有足突融合、線粒體減少和嵴分裂等情況,局部還有少量空泡變性等現象。糖腎煎-L、M、H組及二甲雙胍組也有基底膜增生、足細胞排列相對凌亂等情況,但與DN組比較,整體不良現象均有減輕。見圖3。

圖3 各組足細胞結構(TEM,×20 000)

3 討 論

據調查發現,DN已超越其他因素引起的慢性腎病,成為造成終末期腎病的首要因素〔12〕。故而尋找有效治療DN的藥物是目前急需解決的問題。FBG和P2 h BG、SCr和BUN分別是檢測糖尿病和腎功能的幾種重要指標〔13,14〕,當機體出現DN時,這四種指標會出現明顯變化。本研究結果說明,糖腎煎能夠降低DN大鼠血糖,對腎功能損傷也能發揮一定減輕作用。足細胞是腎小囊臟層上皮細胞,它與腎小球基膜、血管內皮細胞共同組成腎小球的血液過濾屏障〔15〕。本研究結果說明,糖腎煎處理對DN大鼠腎組織病理變化和足細胞損傷均具有改善效果。此外,Nephrin在維持足細胞正常形態與功能中發揮重要作用,本研究中DN組大鼠Nephrin蛋白表達明顯低于正常組,與孟加寧等〔16〕研究結果一致;而不同劑量糖腎煎及二甲雙胍處理的DN大鼠Nephrin蛋白表達明顯高于DN組。進一步提示,糖腎煎處理對DN大鼠腎組織足細胞損傷具有保護作用。

足細胞可作為判斷腎臟疾病的一種指標,它與腎小球其他細胞相比,擁有更高的基礎自噬能力,從而清除有害物質,阻止自身變性和損傷〔17〕。因此,自噬對足細胞而言有著重要意義,在維持腎小球穩態中發揮關鍵作用。長期處于高糖環境下會抑制足細胞自噬反應,導致足細胞損傷、腎小球穩態被破壞,推動DN的發展〔18〕。因而激活自噬能夠保護或改善足細胞損傷,減輕腎功能病變。LC3-Ⅱ是判斷細胞自噬活性的重要指標,它的水平與自噬小體數量關系十分密切。p62也是判斷細胞自噬活性的指標之一,但其表達與自噬活性呈反比〔19〕。Puissant等〔20〕研究發現,JNK和AMPK信號通路能夠通過介導p62/SQSTM1表達來調控細胞自噬能力,JNK通路活化能夠降低p62/SQSTM1蛋白表達,提高LC3-Ⅱ蛋白表達,從而來提高細胞自噬能力。本研究結果說明,糖腎煎能夠通過提高JNK磷酸化蛋白表達,激活JNK通路,從而抑制p62/SQSTM1蛋白表達,提高LC3-Ⅱ蛋白表達,幫助足細胞維持正常自噬水平,從而改善足細胞損傷、減輕腎組織病變。