補陽還五湯對糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥大鼠腓腸肌新生血管生成的影響

史翠娟 邵天瑞 吳深濤

(1天津中醫藥大學第一附屬醫院 國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300193;2天津中醫藥大學)

糖尿病性下肢動脈硬化閉塞癥(DLASO)是常見的2型糖尿病大血管并發癥,并隨著糖尿病病程的延長而逐年增加,糖尿病每增加1年,其下肢血管病變可能性增加30%〔1〕,嚴重者可出現潰瘍或壞疽等癥狀,是致殘致死的主要原因〔2〕,全球每30 s就有一人因糖尿病而截肢〔3〕。糖尿病不僅容易出現嚴重大血管缺血性病變,而且側支血管形成代償能力嚴重不足,以致DLASO患者是非糖尿病患者截肢率的5倍。促進血管再生,建立有效的側支循環,不僅能夠改善下肢血管病變,還能相應地改善心腦血管的供血,從而提高患者的生存質量。內皮祖細胞(EPCs)是血管內皮細胞(ECs)的前體細胞,主要參與血管內皮損傷后的修復及新生血管的形成。中醫學認為本病屬于“脈痹”的范疇?！夺t林改錯》記載：“元氣既虛,必不能達于血管,血管之氣,必停留而瘀?！碧崾練馓撗鍪潜静〉幕静C。補陽還五湯作為益氣活血的代表方劑,在臨床上治療獲得了受肯定的療效。本研究通過觀察補陽還五湯對DLASO大鼠的一般情況、體質量、血糖情況、腓腸肌重量、血小板內皮細胞黏附因子(PECAM-1,也稱CD31)、腓腸肌的α平滑肌肌動蛋白(actin)、EPC表面標志物血管內皮生長因子(VEGF)和CD34的影響,探討補陽還五湯治療大鼠DLASO的新生血管生成機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供的清潔級健康雄性SD大鼠,體質量(200±20)g,實驗動物許可證號：SCXK (京) 2019-0008。適應性喂養1 w后隨機分為空白對照組20只,構建模型組40只。

1.2實驗藥物 鏈脲佐菌素(STZ,100 mg,Sigma,產品批號：s0130);補陽還五湯中藥湯劑由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供。生黃芪 (產地：山西,批號：1912189)、地龍(產地：廣西,批號：2001147)、赤芍(產地：內蒙古,批號：1909004)、紅花(產地：新疆,批號：1908027)、川芎(產地：四川,批號：1911159)、當歸(產地：甘肅,批號：1912115)、桃仁(產地：河北,批號：1909145)。

1.3模型制備與分組 空白對照組普通飼料喂養,構建模型組高脂飼料喂養8 w后,第8周通過測試2 h的糖耐量來判斷大鼠胰島素抵抗,然后再以55 mg/kg STZ的劑量進行腹腔注射,構建糖尿病模型。空白對照組大鼠尾靜脈注射同等劑量(25 mg/kg)檸檬酸鈉緩沖液。1 w后構建模型,大鼠血糖>16.7 mmol/L則視為糖尿病模型大鼠構建成功。糖尿病模型構建成功后,將股動脈根部結扎,然后剝離股動脈3個分支并結扎,縫合,建立糖尿病下肢缺血模型。分為模型組20只,中藥干預組20只。

1.4干預方法 補陽還五湯(由生黃芪60 g,當歸、赤芍、地龍、桃仁、紅花各9 g,川芎6 g組成),由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供。灌胃按生藥11.5 ml/(kg·d)〔補陽還五湯處方整方藥物質量111 g/d,人體質量按照60 kg計算,藥物劑量按照與人體質量換算,大鼠與人之間換算系數為6.25,大鼠用藥量為：6.25×111 g/60 kg=11.544 g/kg,為方便計算取劑量為11.5 g/(kg·d)灌胃,配成的中藥湯劑濃度為1 g/ml〕;空白對照組與模型組分別灌胃同等容量的生理鹽水,1次/d,連續4 w。每周取材1次,稱重后處死,取血,取左下肢腓腸肌稱重。

1.5檢測指標與方法 ①大鼠一般狀況及體質量。觀察大鼠精神狀態、反應能力、進食水、排尿、毛發光澤度、尾靜脈注射處有無感染等一般情況。用藥前后測量體質量,并做好記錄。②大鼠血糖監測。用藥前后通過大鼠目內眥取血,測量各組大鼠空腹血糖。③檢測大鼠腓腸肌重量。④免疫熒光染色評估缺血側腓腸肌新生血管密度。將分離的缺血側腓腸肌包埋制成石蠟切片,通過免疫熒光染色缺血側腓腸肌中的α-actin和CD31,進一步評估缺血一側腓腸肌的新生血管密度。⑤對大鼠患側后肢腓腸肌進行橫斷切片,VEGF、CD34免疫組織化學染色統計EPC的增殖情況。

1.6統計方法 采用SPSS26.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠一般情況 空白對照組精神良好,反應靈敏,毛發純白有光澤,飲水及尿量正常;模型組精神萎靡,毛色枯黃少光澤,反應遲緩,飲水及尿量均明顯增加;中藥干預組與模型組比較精神狀態稍好轉,毛色枯黃略有光澤,反應較活躍,但飲水及尿量情況無明顯變化。

2.2各組不同時間點體質量比較 與空白對照組比較,模型組、中藥干預組體質量均明顯下降(P<0.05),模型組、中藥干預組隨著用藥時間延長,體質量有所上升,見表1。

表1 給藥后不同時間點各組體質量

2.3各組不同時間點血糖比較 與空白對照組比較,模型組、中藥干預組各時間點血糖升高(P<0.05,P<0.01),與模型組比較,中藥干預組給藥14、28 d后空腹血糖明顯降低(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 給藥后不同時間點各組空腹血糖

2.4各組不同時間點腓腸肌重量的比較 與空白對照組比較,模型組給藥7、28 d后,中藥干預組給藥28 d后腓腸肌重量明顯下降(P<0.05,P<0.01)。模型組與中藥干預組,隨著用藥時間延長,腓腸肌重量有上升趨勢,見表3。

表3 給藥后不同時間點各組腓腸肌重量

2.5新生血管及α-actin、CD31表達情況 免疫熒光染色結果顯示,與空白對照組相比,模型組血管新生數下降,且隨著天數的增加這一變化更加明顯;與模型組相比,中藥干預組左下肢缺血側腓腸肌組織中CD31、α-actin熒光表達量均增加,微血管數目明顯增多,管腔結構也相對完整,說明給予補陽還五湯后,腓腸肌中的血管新生活躍,新生血管密度增加,且隨著用藥天數的延長這一趨勢更加顯著,見圖1、圖2。

圖1 各組左下肢腓腸肌組織中CD31表達(免疫熒光,×400)

圖2 各組左下肢腓腸肌組織中α-actin表達(免疫熒光,×400)

2.6VEGF、CD34表達的差異 模型組患側的EPC數量較空白對照組明顯減少,表明糖尿病導致大鼠EPC數量下降,下肢血流恢復受損。而經中藥分別灌胃7、14、21、28 d后,中藥干預組EPC數量逐漸增加,見圖3、圖4。

圖3 各組下肢肌組織VEGF蛋白表達(免疫組化,×400)

圖4 各組下肢肌組織CD34蛋白表達(免疫組化,×400)

3 討 論

相關研究表明,6.5%～50.0%的糖尿病患者可能會并發糖尿病下肢血管病變〔4,5〕。DLASO臨床表現以肢端發涼、肌肉萎縮、間歇性跛行、靜息痛,趾端麻木、針刺感、動脈搏動減弱或消失等癥狀為主,高血糖是其最主要的發病誘因,血管內皮損傷是下肢缺血形成的重要因素。長期高血糖患者的外周血中的血管內皮組細胞數量減少,血管新生及損傷修復能力顯著下降,導致下肢血管病變的生成〔6〕。

一般情況下,非糖尿病外周血管疾病患者其側支循環的建立足以代償阻塞部位的血流喪失,但糖尿病患者因其側支血管新生能力受損而使心肌、肢端等靶器官嚴重缺血。傳統藥物、血管生長因子治療,介入手術及外科手術等血運重建在一定程度上改善了肢體供血緩解了臨床癥狀,但仍有部分患者無法實現再血管化,且有些治療存在一定的風險,因此早期積極防治顯得尤為重要。糖尿病血管病變呈彌漫性,改善組織缺血區域血液灌注相對困難,通過形成新生動脈血管改善缺血顯得尤為重要。EPCs主要來源于骨髓,在成人外周血中僅有少量存在,但是損傷血管修復及新生血管生成中發揮了重要作用〔7〕。一方面通過分泌VEGF等細胞因子,促進缺血組織的血管新生,另一方面通過動員、遷移、歸巢和分化參與損傷血管的再內皮化和血管新生〔8〕。

補陽還五湯出自清代王清任的《醫林改錯》,是中醫治療缺血性損傷的傳統名方,古代主要用于治療腦卒中所致的偏側肢體活動不利,語言欠流利,口角流涎、大便秘結、小便頻數或遺尿不禁〔9〕;現代臨床廣泛用于治療腦梗死、冠心病等大血管病變及其他血管性栓塞疾病〔10〕。方中重用大劑量黃芪為君藥,大補脾胃元氣,氣為血之帥,補氣以行血,血行則瘀消絡通;當歸養血活血,祛瘀而不傷血,為臣藥;桃仁、紅花、川芎、赤芍增強當歸活血化瘀之力,地龍為蟲類藥,蟲咬善走竄,行散力強,通經活絡均為佐藥。諸味共用,標本兼治,氣旺血行以治本,瘀消絡通以治標。前期研究〔11,12〕證實,補陽還五湯與常規治療相比,降糖調脂無差別,但其能明顯改善臨床癥狀,改善下肢血流動力學指標,抑制血小板聚集,減少下肢動脈血栓的形成,減少炎性因子釋放。進而證實加味補陽還五湯明顯改善缺血癥狀,降低截肢率及術后再狹窄發生率,促進血流恢復。黃芪提取物〔13〕可顯著提高動脈粥樣硬化家兔外周血中EPCs的黏附、遷移及增殖能力;通過上調細胞內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達而增強EPCs的血管生成能力。

本研究提示,DLASO大鼠存在精神萎靡、行動活躍性下降、體質量下降、腓腸肌肌肉萎縮,而補陽還五湯治療后能改善上述癥狀,增加體質量及腓腸肌重量,對血糖有一定的改善作用;腓腸肌中的血管新生活躍,新生血管密度增加。EPC細胞難以直接檢測,但其有表面標志物。既往相關研究〔14〕顯示,早期的EPC表面主要表達CD133 、CD34及VEGF受體(VEGFR)-2及CD45,晚期EPC則主要表達CD133 、CD34及VEGFR-2〔14〕。EPC在分化成熟后的內皮細胞中則不表達CD133〔15〕。

綜上,補陽還五湯能增加缺血下肢的EPC的生成,促進缺血下肢的血管生成,從而改善DLASO大鼠的癥狀。