漢族人群LRRK2基因突變攜帶者與非攜帶者患家族性帕金森病的風險預測

趙麗麗 張碩 張洋 王鵬 姜立剛

(1吉林醫藥學院附屬醫院,吉林 吉林 132000;2北華大學基礎醫學院)

家族性帕金森病(PD)通常與遺傳基因存在一定的相關性,因此表現出一定的家族聚集性和區域性。目前研究已經發現有多種基因與該疾病的發生發展相關,如MAPT基因〔1〕、SNCA基因〔2〕及LRRK2基因〔3,4〕等,其中,LRRK2基因突變與PD的易感性的相關性已經成為目前研究的熱點。隨著研究的深入,LRRK2基因越來越多的突變位點被發現,同時也發現LRRK2基因突變位點種類具有很強的地域差異性,如p.G2385R、p.A419V等突變位點在亞洲人種族中被發現〔5〕,而p.M1646T僅在高加索人中發現〔6〕;不僅如此,在不同人種中LRRK2基因突變位點頻率也有所區別,如p.R1398H突變位點在高加索人種中占約7%,而在亞洲人種族中占10%〔7〕。因此,雖然目前針對LRRK2基因突變對家族性PD易感性的關系已經有了部分研究〔8～10〕,但是對于漢族人種、尤其是吉林白山地區漢族人種的LRRK2基因突變類型及對家族性PD易感性的關系還有待進一步的研究。

本研究通過基因測序并運用統計學手段研究漢族家族性PD患者的LRRK2基因突變類型及在家族性PD患者中的分布頻率,并與漢族非PD患者分布頻率進行比較,以確定在吉林省白山地區LRRK2基因突變類型分布頻率,并重點探討LRRK2基因G2385R突變與家族性PD易感性的相關性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Taq DNA聚合酶、dNTP及血液提取試劑盒購自大連TaKaRa公司;LRRK2基因目標擴增序列來源于NCBI網站,基因擴增引物由上海英俊公司訂購,Sanger測序由上海華大基因測序公司完成;聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀器購自杭州朗基科技股份有限公司;凝膠成像儀器購自上海天能科技股份有限公司。

1.2研究對象 于2017年1月至2022年12月在吉林省白山市、撫松縣收集,并經吉林醫藥學院附屬醫院及北華大學附屬醫院確診的58例漢族家族性PD患者為試驗組,并隨機選擇了58例漢族的非PD患者的健康體檢者為對照組。試驗組中男31例,平均年齡(66.1±10.7)歲,平均患病時間為(7.2±5.1)年;女27例,平均年齡為(69.1±12.9)歲,患病時間為(8.4±6.5)年。對照組男31例,平均年齡(68.35±8.64)歲;女27例,平均年齡(68.76±10.48)歲。兩組年齡及性別無統計學差異(P>0.05)。試驗組入選標準是必須符合PD臨床癥狀包含靜止性震顫、動作遲緩及肌肉僵直3項指標中的兩項以上,而對照組入選標準為不符合PD臨床癥狀包含靜止性震顫、動作遲緩及肌肉僵直3項指標中2項以上的健康體檢者,同時采用磁共振成像(MRI)進行診斷明確分組。參與研究的對象均經本人同意并經倫理委員會批準。

1.3樣本提取 抽取試驗組和對照組研究對象的靜脈血5 ml,存于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,取0.2 ml用于全血基因組DNA提取,剩余血液存放于-70 ℃冰箱。全血基因組DNA提取步驟參照血液提取試劑盒(TaKaRa公司)說明書,提取后的基因組DNA存放于-30 ℃冰箱以備實驗使用。

1.4基因型檢測 研究〔5〕發現,在吉林白山地區的LRRK2基因突變類型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4類。本研究針對該4種突變位點設計引物,將樣本基因組DNA進行擴增,取經驗證的產物進行Sanger測序采用Primer5.0設計引物,分別擴增的G2019S(上游引物：5′-TGCTGCCATCATTGCAAAGATTG-3′,下游：5′-TCCCCATTCTACAGCAGTACTGA-3′)、K616R(上游引物：5′-CTTCCTTCCCACCAACAGG-3′,下游：5′-TGTCCATCAAAGTCACAGAGAG-3′)、R1441C(上游引物：5′-AGCAGGCCCAGTTTGAAAG-3′,下游：5′-G ACATTTCTAGGCAGTTGAGAATC-3′)和G2385R(上游引物：5′-GCACAGAATTTTTGATGCTTG-3′,下游：5′-GAGGTCAGTGGTTATCCATCC-3′)4個突變位點。50 μl反應體系對以上4個突變位點進行擴增,反應體系包含1×緩沖液、1 μmol/L上游引物/下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、0.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP),最后加入1 μl全血提取的基因組DNA,最后放入PCR儀器中進行擴增,擴增程序為：95 ℃ 4 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。程序結束后取3 μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(2%)分析,驗證合格后送經上海華大基因進行Sanger測序,以對LRRK2基因上的4個突變位點進行檢測。

1.5磁共振成像(MRI)分析 采用Trio 1.5 T MRI系統(Siemens,Erlangen,Germany)進行MRI分析,患者在整個掃描過程中被要求安靜、閉眼、情緒放松且大腦放空狀態,圖像采用平面回波成像(EPI)收集。層厚3 mm,矩陣256×256,視場24×24;EPI順序為回波時間(TE)2.98 ms,重復時間(TR)2 300 ms,反轉時間(TI)450.0 ms,反轉角度9 °,平均次數(NEX)1,厚 1 mm。

1.6統計學分析 Sanger測序結果采用Chromas2.4軟件分析并統計基因突變型的基因分布,采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1測序結果及LRRK2基因突變型分布頻率 p.G2385R基因突變型在漢族人群中所占的比例較大,且試驗組LRRK2基因突變位點p.G2385R顯著高于對照組(χ2=4.209,P<0.05),其他3組無顯著性差異(均P>0.05)。見表1。

表1 LRRK2基因的基因突變型頻率分布〔n(%),n=58〕

2.2MRI結果 試驗組小腦、腦干未見萎縮,橋前池無增寬第四腦室未見擴張。均可除外PD綜合征;雙側基底節、放射冠、腦干及小腦未見異常信號均可除外多發性腦梗死,更利于排除PD綜合征的診斷。見圖1。

圖1 1例試驗組患者全腦軸向切片MRI

3 討 論

LRRK2蛋白是一種由2 527個氨基酸殘基構成的多功能域的蛋白,目前發現的多中突變形式,而這些突變位點多與疾病的發生發展存在某種聯系,如神經退行性疾病PD就與該基因的某些突變存在相關性,已經有研究證明,LRRK2基因某些多態性突變位點與發散性PD發病風險的相關性〔11〕。LRRK2基因某些多態性突變位點在PD發病過程中起著決定性作用,因此可以作為PD的易感基因。

研究〔5〕發現,在吉林白山地區的LRRK2基因突變類型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4類。本研究中針對該4種突變位點設計引物,將樣本基因組DNA進行擴增,取經驗證的產物進行Sanger測序,結果顯示家族性PD患者中p.G2385R突變型高出非PD患者2.21倍,提示通過人LRRK2基因p.G2385R突變位點的檢測可能能夠預測該攜帶者患有家族性PD的風險,進而給予早期關注和可能的干預。p.G2385R突變位點位于WD40功能區域,該功能域能夠參與LRRK2蛋白的二聚體化,因此在區域發生突變后由于能夠影響LRRK2蛋白的二聚體化而降低該蛋白激酶功能域的活性〔12〕。但是由于LRRK2蛋白參與細胞內的生命活動是一個十分復雜的生物信號轉化作用,雖然p.G2385R位點發生突變后,WD40功能區域如何發生構象變化及LRRK2蛋白如何導致神經細胞功能的異常還有待深層次的研究,但是p.G2385R突變位點能夠作為一種易感基因標志物來評價攜帶者患家族性PD的風險,也為臨床家族性PD診斷和治療提供一種新的方式。