兩種小鼠尾靜脈采血法進(jìn)行血糖檢測(cè)的比較分析

金會(huì)艷，李浩瑜，李 響，劉丁瑜，李 凡

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，云南 昆明 650500；4.云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

C57BL/6J 小鼠的生理機(jī)能較哺乳類動(dòng)物更接近人類[1]，并且在高脂飲食誘導(dǎo)下，C57BL/6J 小鼠患肥胖癥[2]、胰島素抵抗[3]和2 型糖尿病的易感性較其他品系的小鼠高[4-6]，因此C57BL/6J 小鼠是糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及代謝性相關(guān)疾病研究的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。血糖檢測(cè)則是診斷糖尿病和監(jiān)測(cè)其治療效果的有效、快捷方法。在檢測(cè)小鼠血糖的過程中，尤其是連續(xù)多次采血時(shí)，科學(xué)有效的采血方式是獲得準(zhǔn)確血糖值的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，成功的血液采集對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也非常重要[7]。現(xiàn)有小鼠采血方法有鼠尾采血、摘眼球采血、眼眶后靜脈叢采血、心臟采血和斷頭采血等方法[8，9]。由于鼠尾血管豐富，因此從鼠尾靜脈采集血液樣本被廣泛應(yīng)用。但關(guān)于刺破尾靜脈采血與剪尾采血兩種方法檢測(cè)的血糖值是否有差異的報(bào)道較少。因此，本研究通過比較刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法檢測(cè)血糖值來評(píng)價(jià)兩種采血方法的差異及其所測(cè)血糖值的相關(guān)性，從而探討一種穩(wěn)定、有效，且更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的科學(xué)檢測(cè)小鼠末梢靜脈全血血糖值的實(shí)驗(yàn)方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠12 只，10～11周齡，雄性小鼠，體重（23.08±0.34）g，購自云南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）K2021-0001。飼養(yǎng)于云南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滇）K2021-0002。動(dòng)物房室溫20 ℃～25 ℃，濕度30%～60%，12 h 明暗交替。小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠靜脈可視尾注固定器YAN-Q9（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），血糖儀、配套試紙條及一次性采血針（ACCU-CHEK Performa，德國(guó)羅氏公司），眼科剪，75%酒精，棉簽。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 12 只小鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，于上午8∶00 分別采取尾靜脈刺破采血和剪尾采血兩種方法檢測(cè)其血糖值，兩種采血方法間隔5 min。采血前小鼠置于小鼠固定器中，尾巴自固定器內(nèi)底部順出，以便采血（圖1）。所有實(shí)驗(yàn)操作均通過云南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R[10]和福利原則[11]進(jìn)行操作。

圖1 小鼠固定圖

1.3.2 刺破尾靜脈采血法檢測(cè)小鼠血糖 小鼠置于固定器中，調(diào)整適當(dāng)位置，使小鼠尾部置于紅外燈上，并讓小鼠靜置1 min，使小鼠處于平靜狀態(tài)。在紅外燈的照射下，小鼠尾靜脈清晰可見，在小鼠尾部后1/3 處，用棉簽壓迫尾靜脈近心端，75%的酒精消毒后，用一次性采血針刺破血管，待血液自然流出（圖2）。用血糖儀吸取血液至血糖試紙感應(yīng)區(qū)，讀取血糖值，并用棉簽壓迫采血點(diǎn)止血。

圖2 刺破尾靜脈采血法

1.3.3 剪尾采血檢測(cè)小鼠血糖 完成刺破尾靜脈采血檢測(cè)血糖后，小鼠從固定器中取出，自由活動(dòng)5 min。小鼠再次固定于固定器中，并讓小鼠靜置1 min，使小鼠處于平靜狀態(tài)。小鼠尾部置于紅外燈上保溫，75%的酒精消毒后，在小鼠尾尖部，用眼科剪剪斷尾部使血液自然流出（圖3）。用血糖儀吸取血液至血糖試紙感應(yīng)區(qū)，讀取血糖值，并用棉簽壓迫止血。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。采用線性相關(guān)和回歸分析兩種采血方式檢測(cè)血糖值的相關(guān)性。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 剪尾采血法

2 結(jié)果

2.1 刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法檢測(cè)小鼠血糖值比較 刺破尾靜脈采血法檢測(cè)血糖值為（7.58±0.92）mmol/L，與剪尾采血法的（7.61±1.02）mmol/L 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.203，P=0.843）。

2.2 刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法檢測(cè)小鼠血糖值的相關(guān)性分析 由繪制的散點(diǎn)圖可見，刺破尾靜脈采血法檢測(cè)血糖與剪尾采血法檢測(cè)血糖值有正線性趨勢(shì)，可進(jìn)行相關(guān)性分析。Pearson 相關(guān)性分析顯示，10～11 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠刺破尾靜脈采血法檢測(cè)血糖值與剪尾采血檢測(cè)血糖值有相關(guān)性（t=0.827，P=0.001）。進(jìn)一步采用回歸分析兩種采血方法檢測(cè)血糖值的關(guān)系得到，回歸分析方程式為：y（剪尾采血法）=1.898+0.746x（刺破尾靜脈采血法），見圖4。

圖4 刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法檢測(cè)血糖值的散點(diǎn)圖

3 討論

C57BL/6J 小鼠體型小、繁殖快、成本低、易控制，對(duì)飲食導(dǎo)致的血糖升高易感，因此常用于血糖代謝異常等相關(guān)疾病的研究中。成功采集血液樣本是準(zhǔn)確檢測(cè)血糖值的關(guān)鍵步驟[12]。目前，小鼠采血的方式較多，不同的采血方法對(duì)小鼠的損傷程度、采血間隔及采血量要求等各不相同，因此選擇合適的采血方式，從而獲得高質(zhì)量的血樣，是得到科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，尤其是需要連續(xù)監(jiān)測(cè)血糖的情況下，如口服糖耐量試驗(yàn)、胰島素耐量試驗(yàn)等。連續(xù)采血監(jiān)測(cè)血糖值，為臨床上糖尿病及其并發(fā)癥等相關(guān)研究提供了大量血糖數(shù)據(jù)[13]。

在正常生理體位下，小鼠尾部有4 根明顯可見的血管，即背腹面各有1 根動(dòng)脈，兩側(cè)各有1 根靜脈[14]。對(duì)于連續(xù)多次少量的采集血樣，尾靜脈采血是最佳取血方式，但在采血過程中，刺破尾靜脈與剪斷尾尖獲取血樣檢測(cè)的血糖值是否有差異的研究較少。本研究在鼠尾采血的方法中再細(xì)化取血樣操作方法，以刺破尾靜脈與剪斷尾尖獲取血樣來檢測(cè)血糖值，從而評(píng)價(jià)兩種取血方法的異同及適用性，結(jié)果顯示刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法取樣后檢測(cè)的血糖值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法取樣后檢測(cè)的血糖值呈線性正相關(guān)，提示在檢測(cè)小鼠微量血糖時(shí)，采用刺破尾靜脈采血法和剪斷尾尖采血法均可得到相同的結(jié)果。一方面，由于采血前小鼠固定于小鼠靜脈可視尾注固定器中，小鼠處于相對(duì)平靜狀態(tài)，檢測(cè)的血糖值相對(duì)穩(wěn)定。已有研究顯示[15，16]，應(yīng)激會(huì)引起交感神經(jīng)興奮，腎上腺素和去甲腎上腺素分泌增加，從而使血糖升高。另一方面，小鼠固定于小鼠靜脈可視尾注固定器中，并使小鼠尾部置于紅外燈上保溫，保證采血全過程尾靜脈充分?jǐn)U張，刺破靜脈或剪斷尾尖時(shí)，血液自然流出，避免擠壓血管，影響血液生物學(xué)參數(shù)，從而影響血糖水平[17]。雖然兩種采血方式檢測(cè)出來的血糖值無差異，但在具體實(shí)驗(yàn)中，如口服糖耐量實(shí)驗(yàn)中，在2 h 內(nèi)完成多次采血，選用刺破尾靜脈采血是最佳方法，主要是因刺破血管損傷小，易止血，可反復(fù)多次操作[18]。而剪尾采血法每次取血時(shí)需要剪斷尾尖，如此反復(fù)，小鼠損傷大，不能更好地滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利原則[19]；且越靠近鼠尾根部剪尾，小鼠疼痛感增加，應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致血糖出現(xiàn)波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較不準(zhǔn)確[20]。

綜上所述，刺破尾靜脈采血法與剪尾采血法測(cè)出來的血糖值無差異，但考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利原則，刺破尾靜脈采血法優(yōu)于剪尾采血法，值得臨床應(yīng)用。