LINC02695表達(dá)在糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管中的初步研究

袁 園,朱安民,曾 蘭,龍小鳳,葉 萌,唐 凱,譚 薇△

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,貴州遵義 563000;2.遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院眼科,貴州遵義 563000;3.云陽(yáng)縣人民醫(yī)院眼科,重慶 404500;4.遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,貴州遵義 563000)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)正在成為日益嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)估計(jì),截至2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億,推測(cè)至2045年,這一數(shù)據(jù)可達(dá)7.83億。就糖尿病患者的數(shù)量而言,中國(guó)的患者總數(shù)約為1.409億,居世界首位[1]。DM以持續(xù)性高血糖為特征,表現(xiàn)為全身多處靶器官損害、大血管及微血管合并癥[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是DM患者眼部受累后常見(jiàn)的微血管合并癥,是工作年齡人群患糖尿病后視力障礙和失明的主要原因。增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是導(dǎo)致DM患者視力喪失的常見(jiàn)和潛在破壞性原因,新生血管形成是其重要特征之一[3-5]。

新生血管形成的過(guò)程涉及多種因子,如近年來(lái)被廣泛研究的“明星因子”血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、糖基化終產(chǎn)物和受體、炎癥因子和趨化因子、增殖物激活受體-γ、生長(zhǎng)因子、微RNA(microRNA)等,但PDR病理性新生血管形成的具體機(jī)制尚不清楚[6-8]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一組長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的非編碼 RNA,其主要定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì),無(wú)蛋白編碼功能,缺少完整的開(kāi)放式閱讀框架,可剪接、加帽或者聚腺苷酸化處理[9-10]。 近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明,lncRNA在眼部疾病中表達(dá)異常,并且可能在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11-12]。LINC02695是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,目前在眼部疾病中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,在前期研究中作者通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)其可能參與DR形成[13]。本研究著重探討LINC02695對(duì)高糖(high glucose,HG)誘導(dǎo)下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)的增殖、遷移和血管新生的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

HRMECs購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,用ECM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2、95%濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ECM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司,2×SYBR Green PCR mix及4%多聚甲醛購(gòu)自北京索萊寶公司,CCK-8試劑及結(jié)晶紫染色劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司,基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司,TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,PrimeScriptTMRT reagent試劑盒購(gòu)自日本Takara公司,LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司。LINC02695、VEGF及β-actin引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成。pcDNA-3.1-si-LINC02695、pcDNA-3.1載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。LINC02695干擾序列(si-LINC02695)共3條,均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成,具體見(jiàn)表1。NanoDrop LITE分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,i3x多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

表1 si-LINC02695干擾序列

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

HRMECs以2×105/L接種于6孔板中,孵育24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將HRMECs分為4組,分別為正常糖(normal glucose,NG)組、HG組、HG+LINC02695沉默(HG+si-LINC02695)組、HG+沉默對(duì)照(HG+si-NC)組,后2組用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-siLINC02695和pcDNA3.1空載體,最終轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L。

1.2.2RNA提取和qPCR

采用TRIzol 試劑提取各組HRMECs的總RNA后,使用NanoDrop LITE分光光度計(jì)測(cè)定各組總RNA濃度,將所得的總RNA使用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以CFX96 qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。所需的引物序列如下：LINC02695正向引物為5′-GAT CCA AGA GAT GCA GAG GCT AAG C-3′,反向引物為5′-TGT GGA GAG GCA GGC TTC AGA G-3′;VEGF正向引物為5′-CTT CGC TTA CTC TCA CCT GCT TCT G-3′,反向引物為5′-GCT GTC ATG GGC TGC TTC TTC C-3′;β-actin(內(nèi)參)正向引物為5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′,反向引物為5′-TGA TCT TCA TTG TGC TGG GTG-3′。采用2-ΔΔCt公式計(jì)算LINC02695及VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.3CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖能力

各組細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后每孔按照10∶1比例加入ECM培養(yǎng)基-CCK-8混合液110 mL,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h后于i3x多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀中檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下細(xì)胞的吸光度[A(450)]值,同條件下檢測(cè)3次。

1.2.4Transwell測(cè)定細(xì)胞遷移能力

各組細(xì)胞用含有5%胎牛血清(FBS)的NG/HG ECM培養(yǎng)基將其稀釋為4×105/mL,接種于24孔的Transwell孔板小室內(nèi),下室加含有20% FBS NG/HG ECM培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2、95%濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,用濕潤(rùn)棉簽擦拭掉小室微孔膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞,PBS清洗3遍,小室微孔膜外側(cè)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min,取下微孔膜放入載玻片上,滴1滴中性樹(shù)膠封片。制片完成后置于顯微鏡下觀察并拍照,照片用Image J軟件計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.5細(xì)胞成管能力測(cè)定

在96孔板中加入50 μL/孔Matrigel基質(zhì)膠,置于37 ℃、5% CO2、95%濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h使其凝固,各組細(xì)胞按照4×105/mL密度接種于包被Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。8 h后取出96孔板置于顯微鏡下觀察并拍照,照片用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞成管節(jié)點(diǎn)數(shù)及分支數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HG環(huán)境下的HRMECs LINC02695、VEGF mRNA表達(dá)情況

qPCR結(jié)果顯示：與NG組比較,HG組中細(xì)胞LINC02695、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

a：P<0.05。

2.2 干擾序列選擇

由si-LINC02695轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后進(jìn)行qPCR檢測(cè)LINC02695表達(dá)情況,結(jié)果顯示,3個(gè)siRNA-LINC02695序列中,序列2(si-LINC02695-2)的轉(zhuǎn)染效率最高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),故選其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的siRNA,見(jiàn)圖2。

①：si-NC;②：si-LINC02695-1;③：si-LINC02695-2;④：si-LINC02695-3;a：P<0.05。

2.3 HG環(huán)境下沉默LINC02695對(duì)HRMECs中VEGF mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果顯示：與HG組比較,HG+si-NC組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05),HG+si-LINC02695組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

①：NG組;②：HG組;③：HG+si-NC組;④：HG+si-LINC02695組;a：P<0.05。

2.4 沉默LINC02695對(duì)HG誘導(dǎo)的HRMECs增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NG組比較,HG組細(xì)胞增殖能力升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HG組比較,HG+si-NC組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化(P>0.05),HG+si-LINC02695組細(xì)胞增殖能力明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

①：NG組;②：HG組;③：HG+si-NC組;④：HG+si-LINC02695組;a：P<0.05。

2.5 沉默LINC02695對(duì)HG誘導(dǎo)的HRMECs遷移的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與NG組比較,HG組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HG組比較,與HG+si-NC組遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05),HG+si-LINC02695組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5。

A：Transwell遷移圖;B：定量統(tǒng)計(jì)分析圖;①：NG組;②：HG組;③：HG+si-NC組;④：HG+si-LINC02695組;a：P<0.05。

2.6 沉默LINC02695對(duì)HG誘導(dǎo)的HRMECs管形成的影響

管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與NG組比較,HG組細(xì)胞節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HG組比較,HG+si-NC組細(xì)胞節(jié)點(diǎn)數(shù)和分支數(shù)無(wú)明顯變化(P<0.05),HG+si-LINC02695組細(xì)胞管形成數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。

A：各組細(xì)胞成管圖;B：細(xì)胞成管節(jié)點(diǎn)及分支數(shù)定量統(tǒng)計(jì)分析圖;①：NG組;②：HG組;③：HG+si-NC組;④：HG+si-LINC02695組;a：P<0.05。

3 討 論

目前普遍認(rèn)為,DR是全世界工作年齡人群中糖尿病相關(guān)視力損傷或喪失的主要原因[14-15]。其治療方式主要有控制高血糖、高血壓、高血脂、激光治療、抗VEGF治療及玻璃體切除術(shù)等,盡管廣泛的臨床試驗(yàn)證明了這些治療方法的應(yīng)用價(jià)值,但這些療法在臨床應(yīng)用中不可避免地受到一定的限制,治療負(fù)擔(dān)重、難度大等挑戰(zhàn)依然存在[16-19]。因此,有必要對(duì)DR進(jìn)展的病理過(guò)程和相關(guān)參與因子進(jìn)行深入探討,為DR的診斷和治療提供新思路。

病理性的新生血管形成是PDR的一個(gè)重要特點(diǎn)。由于新生血管不穩(wěn)定,血管內(nèi)容物容易漏出,造成玻璃體積血和視網(wǎng)膜脫離,最終導(dǎo)致視力喪失[20-22]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA廣泛存在于眼內(nèi)各種組織中,其異常表達(dá)可能參與眼部各種疾病,其中就包括DR。大量研究發(fā)現(xiàn),lncRNA的異常表達(dá)與DR病理過(guò)程相關(guān),并被認(rèn)為是參與病理性新生血管形成的重要調(diào)節(jié)因子之一[23-26]。例如有研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MALAT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-205-5p/VEGF-A參與DR的病理過(guò)程,敲低lncRNA MALAT1后可在HG條件下抑制HRMECs增殖、遷移和管形成[27]。

既往有研究分別提取了患有PDR或特發(fā)性黃斑裂孔患者的玻璃體液,并通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)兩者差異的lncRNA進(jìn)行檢測(cè),隨后用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)LINC02695在HG組中表達(dá)上調(diào)[6],與芯片結(jié)果相符,但LINC02695在DR中的作用及具體分子機(jī)制尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

本研究旨在探討LINC02695在HG環(huán)境下HRMECs中的表達(dá)及作用,以期為DR的防治提供新靶點(diǎn)。VEGF為目前已被廣泛認(rèn)可參與DR發(fā)展并應(yīng)用于臨床的因子[28-30],故本實(shí)驗(yàn)還研究了LINC02695與VEGF的關(guān)系。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HG誘導(dǎo)下HRMECs中的LINC02695及VEGF表達(dá)上調(diào),HRMECs的增殖、遷移及新生血管形成明顯增加。這說(shuō)明HG環(huán)境可能會(huì)促進(jìn)HRMECs增殖、遷移及新生血管生成。本研究還發(fā)現(xiàn)LINC02695可能是參與調(diào)節(jié)HG環(huán)境下HRMECs的新生血管過(guò)程的因子之一,通過(guò)沉默LINC02695發(fā)現(xiàn)其可抑制HG誘導(dǎo)下的VEGF表達(dá),而且也同時(shí)抑制HG環(huán)境下的HRMECs增殖、遷移及新生血管形成。上述研究表明,LINC02695可能在DR發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)LINC02695可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF參與HG誘導(dǎo)的HRMECs增殖、遷移及血管生成,為進(jìn)一步探討LINC02695在DR發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制提供了參考,這或許能在未來(lái)為DR的防治提供全新靶標(biāo)。但是LINC02695參與DR發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍不清楚,還需進(jìn)一步研究。