采用自適應光學掃描激光檢眼鏡系統觀察健康成年人黃斑區視錐細胞的分布

趙 玥,楊婷婷,姚 進

0 引言

自適應光學掃描激光檢眼鏡(adaptive optics scanning laser ophthalmoscope,AO-SLO)系統[1-4]作為一種新型的眼科影像檢查設備,是一種利用自適應光學(adaptive optics,AO)技術充分校正人眼像差,結合掃描激光檢眼鏡(scanning laser ophthalmoscope,SLO)獲得視網膜高分辨率視細胞圖像的自動控制系統。目前主要用于對眼底結構的活體顯微成像,提供視網膜細胞及血管的圖像,通過對視網膜圖像進行后處理,獲取如感光細胞密度、血管管徑、血流速度等參數[5-7]。該系統通過校正像差將橫向分辨率提高到細胞級別,光學分辨率可達2 μm[8],不僅在形態上能夠在細胞水平對視網膜進行可視化,而且可以動態觀察細胞及血管的變化,將一些視網膜疾病的發病機制及病理研究提前到細胞未死亡、僅有形態變化的階段,提高了疾病的超早期診斷率,為臨床進一步了解視細胞和視網膜血流的變化提供了無創快捷的影像學資料,為深入了解視網膜和脈絡膜疾病的發病機制開辟了新的途徑。本研究通過AO-SLO系統觀察不同年齡健康人黃斑區視錐細胞,了解其分布特點及其與年齡的相關性,現報告如下。

1 對象和方法

1.1對象選取2023-06/07于我院進行健康體檢者100例200眼,年齡18-65(平均31.73±11.98)歲,其中男45例,女55例。納入標準:(1)行裂隙燈及眼底鏡檢查均未發現明顯器質性病變;(2)醫學驗光矯正視力均≥0.8(小數視力);(3)年齡18-75歲。排除標準:(1)眼壓(intraocular pressure,IOP)>21 mmHg或其他原因不能進行散瞳者;(2)球鏡度超過±2 D或柱鏡度超過±1 D,等效球鏡度超過±2.50 D;(3)眼軸長度≥26 mm或≤23 mm;(4)上瞼下垂等無法充分暴露瞳孔區者;(5)無晶狀體眼或人工晶狀體眼;(6)患有流行性角結膜炎或處于其他傳染性疾病活動期,屈光介質混濁而無法獲得滿意圖像者;(7)固視不良,或其他原因無法配合檢查者;(8)患有高血壓、糖尿病、心臟病等全身疾病或既往有眼部疾病史者;(9)色覺檢查異常者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,已通過南京醫科大學眼科醫院倫理委員會審批[No.倫理新技術字第(2023001)號],所有研究對象均了解本研究相關內容并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1一般檢查納入研究對象均行最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)、IOP、色覺、眼軸、醫學驗光等檢查,并采用共焦激光同步血管造影系統(Heidelberg Spectralis,HRA+OCT)進行光學相干斷層掃描成像(optical coherence tomography,OCT)檢查,對黃斑區視網膜進行區域多線掃描,測量中心凹下視網膜厚度(central macular thickness,CMT)。所有檢查均由同一名醫師完成。

1.2.2AO-SLO檢查采用Mona Ⅱa自適應光學掃描激光檢眼鏡系統(南京博視醫療科技有限公司,設備軟件版本號V1.00.00.221115)進行檢查。檢查前使用5%復方托吡卡胺散瞳,瞳孔直徑大于6 mm且直接、間接對光反射消失后進行檢查,分別采集雙眼中心凹上方(superior)、下方(inferior)、鼻側(nasal)及顳側(tempo)偏心率3°處的2.4°×2.4°視錐細胞層圖像,同一位置重復采集2次并記錄測量結果,取平均值。操作方法:在信息管理界面輸入受檢者基本信息,輸入屈光度及眼軸數據以在掃描中自動校正眼底放大倍率。掃描過程中調整瞳孔相機的位置及景深,確保瞳孔居于中央且虹膜影像清晰后點擊“AO”鍵啟動自適應矯正,通過左右輕微拖動深度調節鍵,確定采集深度,采集圖像前囑受檢者瞬目或多次瞬目后保持睜眼并注視綠色固視燈,確認波前點陣圖清晰規則接近類圓,此時細胞結構鑲嵌最為清晰,然后迅速點擊采集按鈕,等待3 s采集結束即可查看采集圖像的清晰度。在掃描成像過程中,根據機器對焦時調節深度顯示在原位0 μm可知獲得的圖像為橢圓體帶層面,結合已有文獻[9]中電鏡下視錐細胞切片圖及其他自適應光學相關研究,可以判斷掃描的圖像為視錐細胞形態。視錐細胞密度指區域內的視錐細胞數量除以面積的值;細胞間距指每個視錐細胞與其相鄰視錐細胞之間的平均距離。采集時所有圖像的收斂實時信號強度均為90%以上,以保證最終圖像的質量及可信度。所有檢查均由同一名醫師完成。

2 結果

2.1納入研究對象臨床基本資料比較根據年齡將納入研究對象分為4組,其中A組年齡18-30歲,B組年齡31-40歲,C組年齡41-50歲,D組年齡51-65歲,每組各25例50眼。納入研究對象色覺檢查均正常。各組研究對象年齡、BCVA、等效球鏡度差異均有統計學意義(P<0.001),性別構成、IOP、眼軸及CMT差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組研究對象臨床基本資料比較

2.2納入研究對象視錐細胞間距比較各組研究對象雙眼中心凹偏心率3°處2.4°×2.4°范圍平均視錐細胞間距差異均有統計學意義(P<0.001),見表2。

表2 各組研究對象中心凹偏心率3°處2.4°×2.4°范圍平均視錐細胞間距比較

2.3納入研究對象視錐細胞密度比較各組研究對象雙眼中心凹偏心率3°處2.4°×2.4°范圍視錐細胞密度差異均有統計學意義(P<0.001),且各組研究對象各區域視錐細胞密度均呈現較為規律的分布特點,均以顳側視錐細胞密度最高,由高至低依次為顳側>鼻側>下方>上方,見圖1、2,表3。各組研究對象雙眼黃斑區平均視錐細胞密度分別為14144.38±1082.40、13241.24±535.32、12930.29±727.73、10907.50±490.86 cell/mm2,差異有統計學意義(F=83.76,P<0.001),提示隨著年齡的增長,視錐細胞密度呈下降趨勢。

圖1 各組研究對象中心凹偏心率3°處的視錐細胞示意圖(圖像大小100 μm×100 μm)。

圖2 各組研究對象雙眼中心凹偏心率3°處2.4°×2.4°范圍各區域平均視錐細胞密度比較。

表3 各組研究對象中心凹偏心率3°處2.4°×2.4°范圍視錐細胞密度比較

2.4視錐細胞密度與年齡的相關性Pearson相關性分析顯示,納入研究對象100例200眼黃斑區平均視錐細胞密度與年齡呈負相關(r=-0.578,P<0.001),見圖3。

圖3 納入研究對象視錐細胞密度與年齡的相關性。

3 討論

自2000年AO技術首次應用于臨床[2,10-16],即突破了單個細胞的可視化只能使用組織學技術來實現的不足,逐步開展了在視錐細胞、視網膜血管和其他視網膜結構(如玻璃膜疣、微動脈瘤、出血等)方面的多項研究[9,17-19]。由于AO-SLO可以對活體視網膜中單個細胞直接成像,作為更細微的影像形式對其他眼底成像如OCT、光學相干斷層掃描血管成像(optical coherence tomography angiography,OCTA)、眼底自發熒光(fundus autofluoresceine,FAF)、眼底熒光血管造影(fundus fluoresceine angiography,FFA)、吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)等進行補充,從微觀角度觀察視錐細胞改變及丟失的區域和范圍[20],量化測量研究可以幫助臨床得以在區域內進行細胞密度等定量測定,使對細胞的定量觀察成為可能。

視錐細胞通常以六邊形點陣排列[11,21],既往其識別是通過半自動方法,先自動檢測視錐細胞的中心,再由有經驗的人員進行手動校正,較為費力和耗時。目前研發應用于臨床的AO-SLO系統有效提高了視錐細胞的自動檢測分析能力。在對細胞進行識別后,系統自動測量獲得的指標如視錐細胞密度和細胞間距均是有臨床意義的生物標志物。在最初使用時,認為首先進行對于健康眼的檢測分析是非常重要的,因為其結果有助于建立基礎數據庫,獲得健康人生理改變的基礎信息,在臨床中用于評估患眼的異常變化,分析其與健康眼的偏差,對于眼底疾病的早期診斷和監測具有重要的參考價值。

目前已有多項研究發現,視皮質神經細胞、雙極細胞、神經節細胞、色素上皮層細胞及細胞內的黑色素均會隨年齡增長而逐漸減少,視神經纖維束間結締組織常隨年齡增長而逐漸增生,視神經傳導功能減弱[22-25]。本研究發現,中心凹周圍視錐細胞密度同樣會隨著年齡遞增而降低,這與既往研究[26-27]測量的不同年齡健康受試者在不同偏心率上視錐細胞密度的變化結果一致。本研究還發現,盡管不同年齡人群中心凹旁視錐細胞密度會存在一定的波動與偏差,但整體分布仍較為規律,均以顳側密度最高,由高到低依次為顳側>鼻側>下方>上方,分析認為這樣的規律可能與中心凹顳側視網膜血管分布較少有關。此外,本研究發現,50歲以上健康人群中心凹旁各方位視錐細胞密度均下降明顯,在同一放大倍率下觀察不同年齡研究對象的視錐細胞形態,發現功能正常的視錐細胞呈蜂窩狀均勻分布,境界清晰,隨著年齡遞增,尤其是進入50歲以后,區域內的高反射細胞增多,視錐細胞密度減少,細胞胞體及間距增大,但形態仍然規則,推測這可能進一步提示了以上均是與年齡相關的視錐細胞功能下降的特征。

清晰的細胞成像主要取決于受檢者的屈光狀態與屈光介質的清晰程度,因此本研究納入的研究對象等效球鏡度均不超過±2.50 D以保證檢測結果的可靠性。通常球鏡±5.00 D以內,柱鏡±1.5 D以內,眼軸<26 mm的眼成像質量較好。雖然從原理上講眼軸對于成像質量無影響,但實際操作來看,長眼軸(>26 mm)確實會導致細胞成像不理想,主要表現為細胞變小導致成像不清晰,此時可嘗試戴鏡測量,但需受檢者手扶鏡框,保證光學中心與瞳孔對齊。如果成像質量還不理想,則放棄。柱鏡補償理論上可達到±2.00 D,但實際操作中發現>±1.5 D時會出現圖像中央清晰,周邊不清晰的現象,推測可能是由于柱鏡軸向的原因導致清晰位置不同。

由于目前光學成像技術限制,中心凹處的視錐細胞尚無法成像,因此本研究選取中心凹偏心率3°處的位置,考慮到人眼視網膜結構的特點,距離中心凹越遠的位置,視錐細胞密度越小、面積越大,而中心凹偏心率3°處的視錐細胞密度高、體積小,同時可以避開中心凹凹陷結構造成的反射不均勻情況,又最為貼近中心凹,因此對此處最具有代表性的位置進行圖像采集和評估。選取2.4°范圍的視錐細胞主要是考慮到希望有足夠的圖像清晰度和精準度以保證研究結果的準確性,同時一些可能會影響測量結果的因素如屈光介質混濁、淚膜不穩定等,在本研究過程中也均進行了嚴格篩選,基本摒棄了可能存在影響結果的因素。然而,本研究也存在一些不足,如欠缺對于可能與視錐細胞相關的影響因素更為細致的研究,如眼軸、屈光度、中心視力、色覺、眼壓實際值等;未對中心凹偏心率3°以外更大范圍的視錐細胞密度是否會隨著年齡增加而遞減、不同范圍內的差異性以及與其他細胞相關檢測項目進行對照研究等進行探討,這些均有待于臨床進一步觀察。