過表達CASP1誘導人急性髓系白血病細胞THP-1的G0/G1細胞周期阻滯和NLRP3炎性小體介導的焦亡

艾克拜爾·阿布都熱衣木, 徐 麗, 阿孜古麗·麥麥提,阿依姆妮薩·阿卜杜熱合曼, 帕提古力·蘇力坦

(新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院血液內科, 新疆 喀什 844000)

人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)細胞的增殖被異常激活且細胞凋亡被抑制,在體內呈現生長不受控制的爆發性生長[1]。目前,化療、放療、免疫治療和造血干細胞移植是治療AML的主要手段[2],但是AML患者的總體生存率仍然不令人滿意,迫切需要新的治療策略[3-4],然而,對于AML發生機制的研究仍處于初步階段。炎性小體是參與先天免疫反應的胞質多蛋白復合物。含有半胱天冬酶1(Caspase1,CASP1)、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相關斑點樣蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)的NLRP3炎性小體是表征最好的炎性小體之一。盡管NLRP3炎性小體激活的確切機制仍在研究中,然而,目前認為NLRP3炎性小體的形成導致CASP1激活形成cleaved-CASP1,隨后將促炎細胞因子IL-1β或IL-18轉化為成熟的生物活性形式[5]。成熟的IL-1β或IL-18隨后被釋放到細胞外[5]。另外,CASP1的抑制劑VX765被證明可以促進癌細胞的增殖并抑制細胞CASP1/Gasdermin D介導的細胞焦亡(pyroptosis)。這些特征均指向CASP1激活可能促進了細胞焦亡。然而,目前尚不清楚CASP1是否調控AML細胞的焦亡。本文研究過表達CASP1對AML THP-1細胞焦亡和細胞周期阻滯的影響,并探討過表達CASP1誘導AML THP-1細胞焦亡的潛在機制。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:人急性髓系白血病原代細胞THP-1購于于中國科學院上海生物科學研究所。RPMI-1640培養基和胎牛血清均購于美國Gibco公司。CASP1過表達載體(pcDNA3.1-CASP1)和陰性對照(pcDNA3.1-null)構建于美國Invitrogen公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。細胞周期檢測試劑盒購于美國伯樂公司。TRIzol蛋白提取試劑、BCA蛋白測定試劑、超級信號PLUS化學發光底物均購于北京天根生物科技有限公司。細胞活性氧檢測試劑盒和兔抗人增殖相關蛋白Ki67、兔抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),兔抗人細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、兔抗人NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、兔抗人凋亡相關斑點樣蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、兔抗人CASP1、兔抗人切割半胱天冬酶1(cleaved-caspase 1,cleaved-CASP1)、兔抗人白細胞介素(interleukin,IL)-1β,兔抗人IL-18、兔抗人cleaved-Gasdermin D,兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的一抗購于英國Abcam公司。聚偏二氟乙烯膜購于上海碧云天生物科技有限公司。ABI7900快速實時PCR系統(美國卡爾斯巴德應用生物系統公司)SYBR Green PCR主混合物(上海碧云天生物科技有限公司)

1.2方 法

1.2.1細胞培養:THP-1在添加了10% (v/v)胎牛血清和1% (v/v)青霉素/鏈霉素的RPMI-1640中培養,培養箱環境為37℃和5% (v/v) CO2。待細胞生長到對數生長期用于細胞轉染和后續檢測實驗。

1.2.2細胞轉染和分組 用24孔板接種對數生長期的細胞(2×105個/孔),待細胞生長到融合度達到90%時,根據Invitrogen公司轉染試劑盒的說明方法,更換為500μL的無血清RPMI-1640培養基,培養基中含10μL Lipofectamine 3000和0.8μg的pcDNA3.1-CASP1,孵育細胞24h,將該處理命名為pcDNA3.1-CASP1組。使用含10μL Lipofectamine 3000和0.8μg的pcDNA3.1-null的RPMI-1640培養基孵育細胞24h作為pcDNA3.1-null組。另外,用24孔板接種對數生長期的細胞(2×105個/孔),待細胞生長到融合度達到90%時更換為500μL的無血清培養基培養24h作為對照組。最后收集對照組、pcDNA3.1-null組、pcDNA3.1-CASP1組的細胞用于后續實驗。

1.2.3細胞增殖實驗:各組細胞轉染THP-1細胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次,1000 rpm離心10min。細胞濃度通過血球計計數檢測。細胞在96孔板中以5×104細胞/孔立即接種,根據CCK-8試劑盒提供的說明加入10μL CCK-8試劑孵育4h,在490nm處讀取吸光度。

1.2.4細胞凋亡實驗:細胞凋亡實驗中各組細胞以每孔1×106個細胞接種在24孔板中。根據試劑盒提供的說明用Annexin V對細胞進行染色,孵育10min后,并在PI緩沖液中重懸。然后用流式細胞術(FACSCantoTMⅡ)對其進行分析,并檢測其熒光強度。數據分析使用FlowJo軟件分析凋亡細胞的比例。

1.2.5細胞周期分析:各組細胞以1×106的密度接種于24孔板中過夜。在2000rpm下離心5min,在冷PBS中洗滌2次,在75% (v/v)的冷液中重懸。按照碘化丙啶細胞周期染色方案進行細胞周期分析。采用FACSCantoTMⅡ檢測DNA含量。使用FCS Express 7 Flow軟件程序分析數據。

1.2.6Western blot收集各組細胞,使用TRIzol提取試劑分離細胞中全蛋白裂解物。使用BCA蛋白測定試劑檢測蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離50μg的細胞總蛋白,并轉移到聚偏二氟乙烯膜。在4℃下孵育封閉液封閉聚偏二氟乙烯膜,隨后用針對Ki67(1∶500)、PCNA(1∶1000)、cyclin D1(1∶1000)、NLRP3(1∶800)、ASC(1∶800)、cleaved-CASP1(1∶500)、IL-1β(1∶600),IL-18(1∶800)、cleaved-Gasdermin D(1∶1200)的一抗在4℃下孵育過夜,然后加入辣根過氧化酶偶聯的二抗(1∶5000)。內參蛋白為GAPDH(1∶10000),使用SuperSignal West Pico PLUS化學發光底物,檢測感興趣的蛋白,并使用Invitrogen iBright FL1000成像系統進行觀察。

1.2.7實時定量PCR (qRT-PCR):使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從各組細胞中提取總RNA。并將mRNA逆轉錄為互補DNA,并在ABI 7900快速實時PCR系統上使用SYBR Green PCR試劑進行qRT-PCR。使用U6作為內參基因。然后用2-ΔΔCT方法計算相對表達水平。引物(5′～ 3′)序列如下:caspase-1正向ATCCGTTCCATGGGTGAAGGTACA,caspase-1反向CAAATGCCTCCAGCTCTGTAATCA;IL-18正向GCTTGAATCTAAATTATCAGTC;IL-18反向GAAGATTCAAATTGCATCTTAT;IL-1β正向TGCAGTTCACAGAGCAGACC,IL-1β反向GACCGGAAACCTCATGGAG;GAPDH正向GACATTGTTGCCATCAACGACC,GAPDH反向CCCGTTGATGACCAGCTTCC。

2 結 果

2.1過表達CASP1對THP-1細胞增殖的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細胞增殖活力變化無統計學意義(P>0.05),而且Ki67和PCNA的相對表達水平變化無統計學意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的細胞的增殖活力減少,差異有統計學意義(均P<0.05),Ki67和PCNA的相對表達水平減少,差異有統計學意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組細胞的增殖活力減少,Ki67和PCNA的相對表達水平減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1A～1D。

圖1 過表達CASP1對THP-1細胞增殖的影響

2.2過表達CASP1對THP-1細胞凋亡的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細胞凋亡率變化無統計學意義(P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的細胞凋亡率增加,差異有統計學意義(P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的細胞凋亡率增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 用流式細胞術檢測過表達CASP1對THP-1細胞凋亡的影響

2.3過表達CASP1對THP-1細胞周期的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的細胞周期變化均無統計學意義,且cyclin D1的相對表達水平變化無統計學意義(P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的G0/G1細胞周期被阻滯,cyclin D1的相對表達水平(對照組:1.00±0.12 vs.pcDNA3.1-CASP1組:0.52±0.08)減少,差異有統計學意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的G0/G1細胞周期被阻滯,cyclin D1的相對表達水平減少(pcDNA3.1-null組:0.97±0.05 vs.pcDNA3.1-CASP1組:0.52±0.08),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表1。

表1 cyclin D1的相對表達水平

圖3 用流式細胞術檢測過表達CASP1對THP-1細胞周期進程的影響

2.4過表達CASP1對THP-1細胞中炎癥小體的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達水平均增加,差異有統計學意義(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的NLRP3、ASC、cleaved-CASP1的相對表達水平均增加,差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖4和表2。

表2 NLRP3 ASC cleaved-CASP1 CASP1的相對表達水平

圖4 Western blot法檢測各組NLRP3、ASC、cleaved-CASP1、CASP1表達所得到的條帶圖

2.5過表達CASP1對THP-1細胞中CASP1、IL-1β,IL-18 mRNA水平的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA水平差異無統計學意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA水平均增加(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的CASP1、IL-1β,IL-18的相對mRNA表達水平均增加(均P<0.05)。見表3。

表3 CASP1 IL-1β IL-18的相對mRNA

2.6過表達CASP1對THP-1細胞焦亡的影響:與對照組比,pcDNA3.1-null組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。與對照組比,pcDNA3.1-CASP1組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達水平均增加(均P<0.05)。與pcDNA3.1-null組比,pcDNA3.1-CASP1組的IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDa)的相對表達水平均增加(均P<0.05)。見圖5和表4。

表4 IL-1β IL-18 cleaved-Gasdermin D的相對表達水平

圖5 Western blot法檢測各組IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D表達所得到的條帶圖

3 討 論

AML是人類最常見的惡性腫瘤,尤其是兒童和年輕人[6]。此外,在20歲以下人群中,白血病造成的死亡人數超過任何其他癌癥。AML的特點是抑制細胞的凋亡和促進細胞的增殖,因此近年來,AML的治療目標是促進白血病細胞凋亡和抗白血病細胞增殖[7]。先前的研究表明,炎性或病毒感染誘導的炎性小體會導致大多數階段的癌癥發展,并引起細胞焦亡。而最近的研究也表明,細胞焦亡同樣在白血病中扮演重要角色[8]。然而,促進細胞焦亡以阻止AML細胞增殖或生長的研究報道仍然較少。CASP1是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的成員,與細胞凋亡過程密切相關。CASP1及其激活劑NLRP3是炎癥小體的核心成分,CASP1能被NLRP3和ASC所招募從而激活NLRP3炎癥小體,研究表明,CASP1在白血病中的過表達可導致糖皮質激素耐藥[6]。此外,CASP1的遺傳變異與慢性淋巴細胞白血病的風險相關。然而,到目前為止,CASP1對AML的調控作用和機制尚不清楚。因此,本研究探討了CASP1對THP-1細胞行為的調控作用和潛在機制。通過在THP-1中過表達CASP1可明確觀察CASP1對AML的調控作用并探討可能存在的機制,特別是可以深入探討NLRP3炎癥小體激活后THP-1細胞的細胞行為學變化和潛在機制。本研究結果表明,過表達CASP1通過激活NLRP3炎癥小體促進了THP-1細胞的周期阻滯和細胞焦亡。

細胞焦亡的典型途徑中,炎性小體和前CASP1通過ASC與炎性復合體結合,然后激活CASP1。CASP1參與IL-1β與IL-18的激活和Gasdermin D的裂解。然后,GSDMD的N端片段易位到細胞膜上,引起細胞腫脹和孔形成,導致細胞質流出,導致細胞膜破裂。從而導致細胞焦亡。因此,腫瘤細胞的焦亡可以阻止腫瘤細胞增殖[9]。Liu等[6]發現CASP1的mRNA表達水平在白血病細胞系中升高,并且認為CASP1可能參與了AML的發病機制,該報道把CASP1作為預測AML預后的因素和AML患者的治療靶點。在我們的研究中,過表達CASP1明顯促進了細胞的凋亡活性并抑制了細胞的增殖活力,Xu等[9]也發現CASP1過表達可以通過激活細胞焦亡從而抑制前列腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡。這些結果提示了CASP1可能介導了細胞焦亡從而在AML細胞的惡性進展中扮演著重要作用。

研究表明,細胞焦亡發生時,Gasdermin D(53 kDa)被切割,產生30 kDa左右的片段cleaved-Gasdermin D[10]。另外,IL-1β和IL-18則會被大量釋放到細胞中,參與Gasdermin D的切割和細胞腫脹和孔的形成[11]。為了進一步研究CASP1是否通過激活細胞焦亡從而扮演了抑制AML細胞增殖的作用,本研究檢測CASP1過表達后THP-1細胞中CASP1、IL-1β、IL-18、cleaved-Gasdermin D的表達,結果顯示,CASP1過表達可以明顯促進CASP1、IL-1β、IL-18、cleaved-Gasdermin D的表達。因此表明,AML細胞過表達CASP1促進了細胞焦亡。

細胞周期的進展是由不同的細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶及其抑制劑調控的,它們影響核苷酸代謝和DNA復制。cyclin D1通常有助于加速G1/S期的進展。本文數據顯示,CASP1過表達抑制了近50%的cyclin D1表達,減少S期細胞數量,增加G0/G1期細胞數量,提示了THP-1中的CASP1過表達可以形成G0/G1阻滯,從而抑制THP-1細胞的增殖。

綜上所述,本研究初步探討了過表達CASP1誘導THP-1細胞中炎癥小體并激活焦亡相關的信號通路。本研究數據表明,CASP1可以通過細胞周期阻滯和焦亡途徑抑制THP-1細胞的細胞增殖。我們的研究為CASP1作為AML治療靶點提供了新的見解。