世界衛生組織《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄(第2版)》解讀

裴少君 歐喜超

2022年,全球估算新發結核病患者1060萬例,其中,耐多藥/利福平耐藥結核病患者45萬例[1]。推廣應用快速準確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)技術對于耐藥結核病患者早期診斷具有重要臨床意義。近些年,隨著快速分子藥敏檢測技術的廣泛應用,利福平耐藥篩查率得到顯著提高[2]。2012年,全球僅7%的病原學陽性結核病患者接受利福平耐藥性檢測[3];到2022年,病原學陽性結核病患者利福平耐藥篩查率增加到73%[1],并且在此期間,開展耐多藥/利福平耐藥治療的患者從77 321例增加到175 650例,充分表明實驗室診斷在指導結核病治療決策中的核心作用[1,3]。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)建議對所有結核病患者進行利福平和異煙肼耐藥性檢測,并且對耐多藥/利福平耐藥患者進行氟喹諾酮類(fluoroquinolones,FQs)藥物耐藥性檢測[4]。已有商品化的分子藥敏檢測試劑盒可以完成上述藥物耐藥性的檢測[5-6],但目前尚缺乏能夠快速診斷抗結核新藥和再利用藥物耐藥性的分子檢測技術[7-9]。WHO在2023年7月發布《應用新一代靶向測序技術檢測耐藥結核病:快速通告,2023》,推薦了幾種基于靶向測序的耐藥結核病分子診斷技術[10]。新一代靶向測序技術可以通過對臨床標本直接檢測,實現對十幾種抗結核藥物耐藥性的快速判定,但基于目前對部分二線抗結核藥物尤其是新藥的耐藥分子機制仍然知之甚少,從而限制了靶向測序耐藥檢測技術的檢測效能。

2021年WHO發布第1版《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄》(以下簡稱《目錄》),第1版《目錄》包含高質量、全面的表型耐藥相關基因突變列表及其置信度分級[11],但納入菌株的地理區域代表性較差,且有關新藥和再利用藥物耐藥相關基因突變的數據非常有限。因此,WHO于2023年修訂并發布《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄(第2版)》。新版《目錄》包含約52 000株結核分枝桿菌的全基因組測序數據及表型藥敏試驗結果,納入分析菌株數量較第1版增加14 000株,同時,修訂的《目錄》創建了分析方法,藥物覆蓋范圍也更加全面,包括所有一線抗結核藥物(利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺),以及A組(左氧氟沙星、莫西沙星、貝達喹啉、利奈唑胺)、B組(氯法齊明)和C組(德拉馬尼、阿米卡星、鏈霉素、乙硫異煙胺、丙硫異煙胺)二線藥物。筆者重點從第1、2版《目錄》差異入手,對《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄(第2版)》進行解讀。

一、優化分析流程

第2版《目錄》相較于第1版,提供了更加集中、高效、開源、可持續的分析流程,以減少未來《目錄》更新的工作量。在第1版《目錄》中,所有表型/基因型藥敏試驗數據和所有計算過程,均基于訪問受限的學術高性能計算集群。在第2版《目錄》中,所有數據和計算過程都轉移到WHO監督的云服務器中,構建基于開源關系型數據庫管理系統的樣本標準數據庫(GenPhenSQL),并將后續生物信息學處理及耐藥相關性統計分級的分析流程存儲在Github中(https://github.com/GTB-tbsequencing/mutation-catalogue-2023)。整個分析流程可移植到任何云服務器上運行,實現了數據的規范化管理與標準化分析。

(一)數據采集

第1版《目錄》涵蓋的菌株相關分析數據集主要來自出版物、CRyPTIC聯盟,以及各個國家為響應WHO全球結核病規劃貢獻的呼吁而直接提交的數據集。第2版《目錄》在此基礎上實現了與國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)或歐洲核苷酸檔案館數據庫(European Nucleotide Archive,ENA)的同步更新,可以獲取更多公開數據。因此,第2版《目錄》納入菌株數量更多,67個國家貢獻菌株數量大于5株,耐藥菌株所占比例也有顯著提升,尤其是新藥及再利用藥物耐藥菌株。

(二)表型藥敏數據

第2版《目錄》對表型藥敏試驗結果的可信度進行了更細致分層。其根據WHO對不同藥敏試驗方法的認可程度,將表型藥敏試驗數據分為8個層級,前3個層級為使用WHO推薦試驗方法得到的數據集(WHO數據集)。第1層級包括根據最新WHO推薦的關鍵濃度[5,12]所得到的基于固體培養或者MGIT液體培養方法的藥敏試驗數據,以及以1 mg/L作為利福平關鍵濃度和以0.4 mg/L作為異煙肼關鍵濃度獲得的顯微鏡觀察藥敏試驗(MODS)數據[13-14];第2層級為基于低于之前WHO推薦的關鍵濃度,但高于當前WHO推薦的關鍵濃度獲得的莫西沙星藥敏試驗數據[15];第3層級包括根據基于之前的WHO推薦的關鍵濃度所得到的基于固體培養或者MGIT、BACTECTM460液體培養方法的藥敏試驗數據;第4層級包括未標注所采用WHO推薦關鍵濃度版本的基于固體培養或者MGIT BACTECTM460液體培養方法獲得的藥敏試驗數據;第5～8層級為其他表型藥敏試驗方法獲得的數據,包括基于微量肉湯稀釋法的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)藥敏試驗等。這種分層方式能夠創建更為標準化的數據集,為后續分析奠定基礎。

(三)全基因組數據分析方法

第2版《目錄》對全基因組測序數據分析方法進行了更新,采用Freebayes識別小于15 bp的變異,并加入delly識別大片段缺失,可獲得更為全面和準確的變異列表。保留等位基因頻率≥75%(第1版為90%)的變異進行后續關聯分析,同時,對等位基因頻率閾值下調到25%進行額外評估,有助于探究異質性耐藥對藥敏試驗結果的影響。除此之外,第2版《目錄》采用人類基因組變異協會命名法對變異進行了規范化注釋。

(四)基因突變耐藥關聯分級方法

第2版《目錄》補充完善基因突變與耐藥相關性分級方法,擴充了候選耐藥基因,并規范了其上游/增強子序列的范圍。第1版《目錄》僅包括了49個候選耐藥基因,第2版《目錄》擴充到68個,增加的基因包括參與甘油代謝的glpK,以及參與類固醇和有機酸代謝的Rv1129c等,部分基因從第1版《目錄》候選基因中移除,例如,fprA及aftB從阿米卡星的第2層級耐藥候選基因中移除。第1版《目錄》中候選耐藥突變的范圍包括各個耐藥候選基因及其上游100 bp的范圍,第2版《目錄》中對每個基因的上游區域都進行了定義。第2版《目錄》進一步完善“附加分級規則”。例如,修訂了功能缺失突變的定義,將框內突變從功能缺失突變中移除;將交叉耐藥性加入附加規則中,Rv0678和pepQ突變會導致貝達喹啉和氯法齊明交叉耐藥,fabG1和inhA突變會導致乙硫異煙胺和異煙肼交叉耐藥(表1)。第2版《目錄》修改了第4/5組(可能與敏感相關的突變)算法,僅將在WHO數據集中,突變單獨發生時的陽性預測值95%置信區間上限小于10%的突變列為第4/5組,將不滿足上述要求的同義突變也歸為第4組。

表1 世界衛生組織《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄(第2版)》基因突變與耐藥相關性分級候選耐藥基因

二、更新耐藥基因突變目錄

(一)基因突變及其分級列表

第2版《目錄》共有246個1組(與耐藥相關)突變,其中,包括53個第1版的2組突變及18個第1版的3組突變,另有8個突變未出現在第1版《目錄》。第2版《目錄》共有1122個2組(暫定與耐藥相關)突變,包括107個第1版3組突變,126個未在第1版《目錄》中出現的突變。需要注意的是,第1版《目錄》中有13個1組突變下調到了2/3組。此外,第1版《目錄》的106個2組突變下調到第 3/4 組,主要是框內突變(表2)。新藥和再利用藥物耐藥相關基因突變顯著增多,其中,貝達喹啉、氯法齊明在第1版《目錄》中未找到滿足1/2組要求的突變,第2版《目錄》中貝達喹啉增加了5個1組突變和81個2組突變,氯法齊明增加了2個1組突變及56個 2組突變。對于利奈唑胺,第1版《目錄》有1個 1組突變,第2版《目錄》在此基礎上增加了7個2組突變。對于德拉馬尼,第1版《目錄》有1個2組突變,第2版《目錄》在此基礎上又增加了23個2組突變。除此之外,第2版《目錄》對異煙肼和莫西沙星的耐藥相關突變進行了高/低水平耐藥的標注。

(二)基因型耐藥預測性能

第2版《目錄》對大多數藥物基因型耐藥預測效能值與第1版《目錄》較為接近,1組和2組突變組合預測的敏感度≥70%,特異度≥90%(表3)。2組突變對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物的耐藥預測效能無明顯影響,但對于吡嗪酰胺和乙硫異煙胺,2組突變能夠明顯增加其耐藥預測效能。第2版《目錄》對新藥和再利用藥物的基因型耐藥預測效能均明顯提升,但耐藥檢測敏感度仍不足50%,對新藥和再利用藥物的耐藥機制還有待深入研究。

表3 世界衛生組織《結核分枝桿菌耐藥相關基因突變目錄(第2版)》基因型耐藥預測效能

三、未來《目錄》研究展望

(一)完善數據集

通過收集更多菌株全基因組測序和抗結核藥物MIC數據,用以探究基因突變與耐藥水平高低的相關性?！督Y核病整合指南模塊3:診斷:結核病快速診斷》中表明,異煙肼和莫西沙星的耐藥水平對治療效果具有明顯影響[4],但目前關于不同耐藥基因突變類型所造成的耐藥程度差異還有待進一步證實。例如,是否所有katG突變都會賦予高水平異煙肼耐藥性,對于較罕見的氟喹諾酮類藥物耐藥突變,需要更多的MIC值去確定其耐藥水平的高低[15-16]。一些突變僅造成MIC值的小幅升高,如果僅升高到臨界濃度附近,則很難對其進行耐藥與敏感的精準判讀[17-18]。需要進一步增加納入分析數據的代表性,降低數據偏倚;同時,還要覆蓋更多譜系菌株以探究譜系對耐藥性的影響[19-20],并收集更多既有耐藥菌株又有敏感菌株的數據集,以降低對耐藥性的高估。

(二)優化分析流程

關于測序數據生物信息學分析流程,應進一步加入大片段插入(如IS6110)分析,研究其對藥物耐藥性的影響[21],并從核苷酸水平探究核苷酸突變對耐藥性的影響,包括導致同一氨基酸突變的不同核苷酸突變對耐藥性的影響[22-23]。現有生物信息學分析流程主要針對二代高通量測序數據,未來應考慮構建同時適用于三代測序數據的分析流程。對于基因突變耐藥關聯分級方法,一方面要繼續優化“附加分級規則”,例如rpoBT427A雖然在利福平耐藥性決定區(RRDR)中,但可能不導致利福平耐藥[24-25]。還需要繼續更新候選耐藥基因,例如,dprE2(Rv3791)可能是德拉馬尼和普托馬尼的潛在耐藥相關基因[26]。未來建議通過加入回歸等其他的分級方法,對補償性及上位性突變進行深入研究與分類。

四、結語

目前,商品化分子藥敏檢測試劑盒已廣泛應用于臨床耐藥結核病診斷。隨著測序技術的普及,以高通量測序技術為基礎的新一代靶向測序試劑盒也將逐步應用于耐藥結核病診斷。這些技術可以在短時間內獲得多種藥物的耐藥性信息,進而指導治療決策。分子藥敏檢測技術可靠性和實用性的提高取決于對抗結核藥物耐藥機制研究的不斷進步,《目錄》可為分子藥敏檢測靶標選擇提供標準化參考。但當前《目錄》的算法僅考慮藥物候選基因突變與耐藥的相關性,未能對新的耐藥相關基因進行挖掘?；凇赌夸洝匪a生的海量數據,未來在機器學習及神經網絡算法的支持下,可以嘗試從基因組學出發,對新的耐藥相關基因進行探究[27-28]。此外,《目錄》在實用性上也有待進一步提升。《目錄》中1組和2組突變位點與目前商品化分子檢測試劑盒的檢測靶點存在一定的差異(如ahpC突變位點),且《目錄》中包含的耐藥突變位點數目眾多,但商品化分子藥敏檢測所能覆蓋的檢測靶點有限,需要篩選出發生頻率高、與高水平耐藥相關等特征的突變位點作為商品化分子藥敏檢測試劑盒的檢測靶點。因此,建議未來《目錄》對目前已有的分子藥敏檢測技術覆蓋的檢測靶點進行評估,并且對耐藥相關位點進行靶點推薦性排序。除此之外,還需要考慮《目錄》在更新過程中的一致性。例如,第2版《目錄》與第1版《目錄》在突變的命名上有較大的改變,不利于對兩版《目錄》進行對照。建議對每次更新過程中新增和移除的耐藥相關突變進行額外評估,為更新的必要性提供更多的證據支撐。未來,相信《目錄》在更多數據集的支持下,將能夠進一步提高通過耐藥基因突變預測抗結核藥物耐藥性的效能,尤其是對新藥和再利用藥物耐藥性的預測。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻裴少君:采集數據、起草文章;歐喜超:起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱和指導