補腎中藥復方對高鹽攝入去卵巢大鼠骨代謝及ENaCα、NCC和ClC-3表達的影響*

崔 琰， 孫珂煥， 詹小瑤， 莫 樞， 肖雅雯， 王攀攀，楊 麗， 張榮華△， 朱曉峰△

（1暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510632；2暨南大學中醫學院，廣東 廣州 510632；3深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518025；4深圳市中醫院，廣東 深圳 518000；5暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632）

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）是具有骨密度降低和骨微結構破壞特點的慢性疾病，由其引發的脆性骨折是患病群體失能、失用的主要原因，骨質疏松癥已經成為我國50 歲以上人群的重要健康問題之一，絕經后女性骨質疏松問題尤為嚴重[1］。隨著飲食與骨代謝疾病關系研究的深入，飲食營養已經成為與內分泌失調、代謝紊亂及機械因素同樣顯著影響OP發生的主要因素之一[2-3］，尤其氯化鈉在飲食調味中居于主導地位，高鹽飲食作為飲食偏嗜最常見的類型，已被證實不僅與高血壓、心腦血管病、腎臟病、腫瘤及肥胖等的發生有關[4-6］，同時也是加速骨丟失的因素之一。

離子通道是細胞膜上一類調節和轉運特異離子穿膜的通道，也是一類特殊親水性蛋白質微孔道，存在于機體內多種生命活動過程，并參與調節細胞的增殖、分化和凋亡[7］。參與骨代謝的間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞上表達多種離子通道如鈉通道、氯通道、鈣通道等的功能障礙與骨代謝疾病關系密切，這些離子通道不僅調節骨系細胞的增殖、分化和凋亡等生理活動，還參與多種信號轉導過程，進而影響骨代謝[8］。

補腎中藥復方（Bushen formulae， BHF）是張榮華教授依據骨質疏松癥腎虛血瘀病機特點，以補腎活血壯骨為治法開處的臨床驗方，臨床治療OP 時取得了良好療效[9］。本研究以高鹽攝入的去卵巢大鼠為研究對象，從骨代謝、電壓門控性氯離子通道3（chloride channel of the ClC gene family， ClC-3）、上皮鈉離子通道α（epithelial sodium channel α， ENaCα）、鈉-氯同向轉運體（Na-Cl cotransporter， NCC）為切入點，探討補腎中藥復方對不同飲食干預的去卵巢大鼠骨代謝的作用機制，拓展補腎中藥復方對骨代謝疾病的多靶點網絡藥理學機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

于廣東省醫學動物中心購買SPF 級3 月齡SD 雌鼠80 只，體重為190～210 g，許可批號：SCXK（粵）2013-0002。飼養于廣州博濟生物醫藥公司，飼養環境條件：環境通風良好、安靜，相對濕度控制在45%～50%，溫度控制在（23±2） ℃。本項目通過廣州博濟生物醫藥公司動物倫理委員會審查。

2 主要儀器與試劑

2.1 主要試劑 骨代謝生物標志物指標檢測ELISA 試劑盒購于上海酶聯生物；大鼠ENaCα、ClC-3 多克隆抗體（Alomone Labs），NCC多克隆抗體（Arigo）。

2.2 儀器 Prodigy 型雙能X 線骨密度儀（GE）；Micro-CT 儀（ZKKS-Sharp-MCT）； 全自動生化分析儀（HITACHI 7600-020）；梯度PCR 儀（Veriti 96-Well，ABI）；熒光定量PCR儀（ABI7500）。

3 方法

3.1 藥物制備 補腎中藥復方由淫羊藿、熟地、骨碎補、當歸、秦艽、中膝和枸杞等7 味藥組成，配比與煎煮方法同既往研究[10］，藥液濃縮至生藥量1 g/mL，干預劑量為7.8 g·kg-1·d-1，每日1次。

3.2 高鹽飼料 實驗用不同質量分數高鹽飼料購置于廣東省醫學實驗動物中心，等級A 級。除了添加不同含量的氯化鈉外，其余均按照常規哺乳動物飲食營養成分添加。氯化鈉含量（質量分數，w/w）分別為：正常飼料（含0.5%氯化鈉）、中等高鹽飲食組飼料（含2.0%氯化鈉）和高鹽飲食組飼料（含8.0%氯化鈉）。

3.3 去卵巢大鼠造模 大鼠飼養3 個月后，將6 月齡80 只SPF 級大鼠經隨機數字表法為假手術組（10只）、去卵巢手術（sham）組（70 只），去卵巢手術（ovariectomy，OVX）組切除大鼠雙側卵巢，假手術組僅切除少量卵巢旁脂肪。具體操作步驟：SD 大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定，腹部術區進行剃毛、消毒，沿腹白線縱行切口約2 cm 以打開腹腔，去卵巢組找到雙側卵巢后予切除并止血，假手術組僅切除少量卵巢旁脂肪，術閉逐層縫合腹腔。

3.4 動物分組及干預 造模1 周后，按隨機數字表法將去卵巢手術組大鼠分為模型組（OVX 組）、中高鹽飲食（medium-high-salt diet， MSD）組、高鹽飲食（high-salt diet， HSD）組、補腎中藥復方（BHF）組、補腎中藥復方+生理鹽水（BHF+NS）組、補腎中藥復方+中高鹽飲食（BHF+MSD）組和補腎中藥復方＋高鹽飲食（BHF+HSD）組，每組各10 只。除補腎中藥復方+生理鹽水組飲水采用生理鹽水模擬淡鹽水送服外，其余均自由飲水和獲取所供不同的飼料，藥物劑量組分別給予相當于成人臨床劑量的3 倍連續給藥灌胃12周。

3.5 骨代謝生物標志物檢測 采用普通非抗凝采血管采集各組大鼠腹主動脈血液樣本，4 ℃靜置分層后，離心取上層血清，依據ELISA 檢測試劑盒說明書操作檢測血清中骨鈣素（bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein，BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）、Ⅰ型膠原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX）、I 型膠原氨基端肽（N-terminal telopeptide of type I collagen，NTX）、雌二醇（estradiol 2，E2）。

3.6 骨組織蛋白表達的檢測 制備濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為10%的電泳凝膠，安裝好電泳裝置，按設計好的上樣順序緩慢上樣，微量加樣器吸取10 μL 樣品緩慢加入樣品孔，SDS-PAGE 電泳結束后經轉膜、洗膜后，置于搖床上封閉1 h，分別與ClC-3、ENaCα、NCC、GAPDH Ⅰ抗稀釋液（1∶1 000）在4 ℃條件下孵育過夜。與Ⅱ抗工作液（1∶2 500）在室溫下孵育1 h 后，應用化學發光試劑顯影，檢測各條帶的灰度值，數據處理，分析蛋白的表達。

4 統計學處理

統計學處理數據運用SPSS 22.0統計軟件分析。結果符合方差齊性檢驗的數據，采用one-way ANOVA，當P＜0.05時，用Tukey HSD 進行兩兩比較；方差不齊時采用Brown-Forsythe 和Welch 檢驗，當P＜0.05時，兩兩比較采用Dunnett’T3 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠股骨骨微結構、骨密度、骨參數比較

在第12 周末檢測骨密度，如圖1 所示，與假手術組比較，OVX 組大鼠骨密度顯著降低 （P＜0.05）；與模型組比較，中高鹽組和高鹽組骨密度進一步下降，但差異無統計學意義（P＞0.05），而補腎方組股骨骨密度顯著增加（P＜0.05）。進一步分析各組骨參數顯示，與假手術組比較，模型組大鼠骨體積分數[BV/TV（%）］、骨小梁數量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均顯著降低（P＜0.05），而骨小梁間距（Tb.Sp）則顯著增加（P＜0.05）；而高鹽攝入后去卵巢大鼠骨微結構則進一步破壞，表現為BV/TV（%）、Tb. N 、Tb. Th 的進一步下降與Tb. Sp 上調，補腎復方攝入后可顯著改善去卵巢模型大鼠骨微結構破壞，經補腎方治療的中高鹽飲食攝入大鼠的骨參數較中高鹽大鼠均有改善（P＜0.05）；同樣，高鹽攝入并予補腎復方干預組其骨參數均較高鹽組有顯著改善（P＜0.05）。此外，與補腎方組比較，補腎方+生理鹽水組的BV/TV%下調且Tb.Sp 上調（P＜0.05），說明生理鹽水的攝入對于補腎復方藥效發揮存在一定影響。

Figure 1. Comparison of bone mineral density and bone microarchitecture parameters by Micro-CT in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖1 各組大鼠股骨骨密度、骨參數比較

2 各組大鼠骨代謝生物標志物指標比較

如圖2 所示，模型組大鼠E2、PINP、BGP 較假手術組下降，但TRACP、CTX、NTX上調（P＜0.05），表明其骨形成能力下降而骨吸收增強。中高鹽攝入后不同程度升高CTX、BGP、PINP 水平，高鹽飲食攝入后進一步下調E2 水平并上調CTX、NTX、BGP、PINP 水平（P＜0.05），表明不同濃度高鹽飲食加劇模型大鼠高骨轉換狀態。補腎方干預后，去卵巢大鼠PINP 表達上調，而CTX水平下降（P＜0.05）；并且補腎方干預可提升高鹽飲食大鼠E2、BGP水平，并下調骨吸收標志物CTX水平（P＜0.05）。同時，在中高鹽、高鹽飲食攝入的基礎上，補腎方能夠分別下調其CTX 及BGP水平（P＜0.05）。此外，補腎方+生理鹽水組大鼠CTX水平較補腎方組升高（P＜0.05），其余骨代謝生物標志物無顯著差異。

Figure 2. Comparison of bone metabolism biomarkers in each group. Quantification of serum E2， TRACP， CTX， NTX， BGP and PINP by ELISA. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖2 各組大鼠骨代謝生物標志物指標比較

3 各租大鼠骨組織病理形態變化比較

如圖3 所示，假手術組大鼠股骨遠端松質骨部位骨小梁形態結構完整，數量密集且排列整齊，骨小梁間可互相連接成網狀，腔內骨髓細胞數量豐富。模型組大鼠股骨骨小梁稀疏，游離端多，網狀結構破壞，骨髓內空泡狀脂肪細胞明顯增多；與模型組比較，中高鹽組和高鹽組大鼠股骨骨小梁稀疏、網狀結構破壞進一步加重，脂肪細胞增多；補腎方組可見股骨骨小梁數量增多，網狀結構修復，脂肪細胞變少。經補腎復方干預后，補腎方+中高鹽組和補腎方+高鹽組可見骨小梁數量增多，網狀結構略微修復，脂肪細胞變少。

Figure 3. HE staining of femur in each group （scale bar=200 μm）.圖3 各組大鼠股骨HE染色

4 各組大鼠骨組織ENaCα、ClC-3 和NCC 蛋白水平比較

如圖4 所示，相較于假手術組，模型組大鼠骨組織ClC-3 顯著下調（P＜0.05），ENaCα 和NCC 表達無顯著變化（P＞0.05），而中高鹽飲食攝入則可上調去卵巢大鼠NCC，并下調其骨組織ClC-3 和ENaCα 表達，高鹽飲食攝入則下調其NCC 表達水平（P＜0.05）。經補腎復方干預的模型大鼠NCC 表達水平下降，ClC-3 表達水平顯著升高，并且與對應的中高鹽組、高鹽組相比，補腎復方的干預能不同程度下調中高鹽、高鹽攝入的大鼠骨組織NCC水平，并上調骨組織中ClC-3 和ENaCα 的表達（P＜0.05），說明補腎中藥復方能調節離子通道的改變。此外，補腎方+生理鹽水組相較于補腎復方組大鼠ENaCα 和NCC 上調，ClC-3 下調（P＜0.05），表明生理鹽水對補腎復方作用機制的發揮存在影響。

Figure 4. The protein expression of ENaCα， ClC-3， and NCC in bone tissues of the rats in each group. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖4 各組大鼠骨組織ENaCα、ClC-3和NCC蛋白的表達

討 論

離子通道對于骨發育和骨穩態至關重要，也是許多藥物作用的靶點[11］。近年來，研究發現成骨細胞和破骨細胞上表達多種離子通道如鈉通道、氯通道、鈣通道和鉀通道等，這些離子通道不僅調節骨系細胞的增殖、分化和凋亡等生理活動，還參與多種信號感知、傳遞及轉導過程，影響骨代謝功能，離子通道對骨系細胞的影響日益受到人們的關注[12-13］。ENaC 主要可通過調控細胞內外Na+的轉運以維持體內鈉離子的平衡，也是許多藥物作用研究的重要靶點[14］。Na+已被證實可影響OB 細胞的分化來干預成骨功能，即低濃度時促進分化，而高濃度抑制分化，成骨相關基因、ENaCα mRNA 的變化與OB 細胞分化活性的變化基本一致，ENaC 也參與OB 細胞在壓力刺激作用下的信號轉導[15］，以調節OB 細胞骨形成能力。本實驗也同樣發現，在高鹽飲食狀態下，股骨ENaCα 蛋白表達均下調，可能是抑制成骨細胞分化的一個新途徑，從而影響骨代謝的變化。

NCC 也成稱為噻嗪類敏感的鈉-氯共同轉運蛋白，噻嗪類利尿劑藥理機制包括促進機體水、鈉的排泄，減少血容量、尿鈣排泄，促進體內鈣平衡，而噻嗪類利尿劑的長期使用被發現可以減少骨折的發生風險、增加骨密度[16］。現代研究還發現此類噻嗪類利尿藥可直接抑制NCC 刺激OB 細胞分化標志物Runx2 和骨橋蛋白的產生，提高礦化結節的形成[17］，且NCC基因的失活能提高OB 細胞成骨分化能力以提高骨密度[18］。本實驗研究也證實了NCC在骨組織中的表達，且隨著體內氯化鈉濃度的增加，NCC 的mRNA 和蛋白表達增加，在一定程度上抑制了成骨細胞活性和分化，誘導骨吸收，導致鈣從骨中丟失，從而影響骨代謝，而補腎中藥復方的干預可調節高鹽飲食引起NCC 的mRNA 和蛋白表達的改變，說明補腎中藥復方就有一定的治療效果。ClC-3 氯通道與骨代謝也有密切關系[19］，通過檢測ClC-3 在小鼠MC3T3-E1 細胞中的表達，結果表明骨形成標志物ALP、OCN 和Runx2 的mRNA 表達水平與ClC-3 表達水平成正相關，并呈高表達。而RNAi 介導的ClC-3基因沉默可下調這些成骨標志物的表達[20］。在本研究中，隨著高鹽飲食的增加，ClC-3 蛋白表達量下調，因而推斷ClC-3抑制了去卵巢大鼠成骨分化，使骨吸收大于骨形成，從而直接影響骨代謝，補腎方干預后的補腎方+中高鹽飲食組和補腎方+高鹽飲食組與其相對應的高鹽飲食組比較，均可不同程度的調節ClC-3 蛋白表達的改變，說明補腎中藥復方的調節作用。此外，《本草綱目》曰：“故服補腎藥用鹽湯者，咸歸腎，引藥氣入本臟也”，中醫學認為，味咸的中藥多歸腎經，歷代醫家應用補腎壯骨藥物時，也常用鹽作為引經之藥，本研究納入的補腎方+生理鹽水組研究也為該理論的科學內涵提供了更多依據。

綜上所述，高鹽飲食可引起股骨組織的相關離子通道ENaCα 和ClC-3 的表達下調，NCC 的表達上調，從而直接影響骨系細胞活性，引起骨形成的減少和骨吸收的增加，改變骨代謝的平衡。同時補腎中藥復方干預能夠不同程度的調節高鹽引起的相關離子通道的改變而發揮藥效作用。