類視黃醇X受體對缺氧/復氧誘導的大鼠II型肺泡上皮細胞氧化應激反應的調控作用*

王肖婷， 徐俊鵬▲， 黃 曼， 陳思安， 張淇昊， 曹文傑，田云娜， 高 慧， 王萬鐵△

（1溫州醫科大學缺血/再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035；2河南大學附屬淮河醫院病理科，河南 開封 475000）

肺原發性移植物功能障礙是一種嚴重的急性肺損傷，導致肺移植后早期發病率和死亡率增加，其發病機制主要是肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury， LIRI）[1］。臨床上大量肺移植、心肺復蘇等手術應用的同時，也大大提高了LIRI 的發生率，由于目前臨床上尚無有效的防治措施，嚴重影響患者的預后康復甚至威脅生命。

LIRI的病理生理機制復雜，一個特定器官由于缺血引起的組織損傷往往會在再灌注時進一步加劇，這一過程比缺血本身更加有害。這一過程需要有氧的存在、血管、體液以及細胞因子的激活和維持[1］，機體在各種有害刺激下，發生氧化應激反應，產生并聚集大量活性氧（reactive oxygen species， ROS），引發一系列細胞和組織病理性反應。當機體遭受不良刺激時，ROS 可在II 型肺泡上皮細胞（type II alveolar epithelial cells， AECII）、內皮細胞、肺泡巨噬細胞等肺組織細胞中的積聚，通過核因子κB（nuclear factorκB， NF-κB）等轉錄因子激活炎癥過程，引起染色質重塑和促炎癥介質基因的表達，從而加劇氧化應激反應，引起肺組織損傷[2-3］。

類視黃醇X 受體（retinoid X receptor， RXR）是繼視黃酸受體之后發現的又一類核受體，主要包括3個亞型，其中以RXRα 研究最為充分。近年來，對RXR 的研究越來越多，人們對于RXR 的作用不斷有了新的認識。研究表明，RXR 廣泛參與腫瘤、糖尿病、心血管疾病等疾病過程[4-5］。研究報道，RXR 激動劑可以通過抑制蛋白激酶C 途徑來增強細胞抗氧化能力，削弱高糖誘導下血管內皮細胞產生的氧化應激反應，其機制可能與RXRα 的抗氧化應激效應有關[6］。AECII是LIRI中主要的效應細胞，故本研究以大鼠AECII 為主要研究目標，通過建立細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation， HR）損傷模型，模擬在體LIRI[7-8］，旨在進一步明確氧化應激在HR 損傷中的發生機制；同時以RXR 為研究靶點，通過RXR 激動劑和抑制劑對AECII 進行預處理，研究RXR 在肺HR 損傷誘導的氧化應激反應過程中的可能作用及其調控機制，從而為在體LIRI的防治提供參考。

材 料 和 方 法

1 實驗細胞

大鼠AECII 系購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 主要試劑及儀器

高糖DMEM 培養液、胎牛血清、青-鏈霉素混合液、PBS、0.25%胰酶（含EDTA）和無血清細胞凍存液為進口分裝或國產分析純；RXR 激動劑9-順式視黃酸（9-cis-retinoic acid， 9-RA）和RXR拮抗劑HX531購自Sigma；CCK-8 試劑盒購自Dojindo；抗表面活性物質蛋白A（surfactant protein A， SP-A）、RXRα 和核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗體購自Abcam；Nrf2 引物設計合成購自上海生工生物工程股份有限公司；即用型BCA 蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒（WST-1 法）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）測定試劑盒（微板法）購自南京建成生物工程研究所。

凝膠成像系統（Bio-Rad）；高通量熒光定量PCR儀（ABI）；透射電鏡（Hitachi）。

3 主要方法

3.1 實驗分組及ACEⅡ缺氧/復氧模型的制備 按照隨機原則將細胞分為：（1）對照（control， C）組：含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液常氧箱內培養30 h；（2）HR 組：低氧箱內（參數37 ℃，1% O2）無糖無血清DMEM 培養液處理細胞6 h 后，使用無血清的DMEM 培養液常氧箱內正常培養24 h；（3）HR+溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）組（HD 組）：在缺氧造模前用含終濃度低于0.1% DMSO 的無血清培養液處理1.5 h；（4）HR+9-RA 組（RA 組）：用含9-RA（100 nmol/L）的無血清培養液預處理細胞1 h，之后進行缺氧/復氧處理；（5）HR+HX531組（HX組）：在缺氧造模前先用100 nmol/L 的9-RA 預處理細胞0.5 h，再用2.5 μmol/L 的HX531 預處理1 h，其余處理同HR組。HR模型參考其他學者研究方法及在本實驗室前期研究基礎上[7-10］，通過預實驗多次實踐再進行整合改進構建大鼠缺氧/復氧模型。細胞缺氧處理用無糖無血清培養液培養并放置于低氧箱6 h后再用不含血清的高糖DMEM 培養液，放置常氧箱恢復氧氣培養24 h。

3.2 免疫熒光標記法 用4%多聚甲醛固定細胞，經打孔處理后，進行封閉處理，滴加相應Ⅰ抗（Nrf2，1∶1 000）后放于濕盒內避光，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3 次后用對應的熒光Ⅱ抗（1∶5 000）室溫避光孵育1 h 后，再次PBS 充分洗滌3 次，使用DAPI 對核進行染色，封片，并在正置熒光顯微鏡下觀察并拍片。

3.3 CCK-8 實驗 根據CCK-8 試劑盒說明書進行實驗，按照VCCK-8∶V培養液=1∶10 進行混合。96 孔板每孔加入110 μL CCK8 和培養液的混合液，37 ℃孵育1 h，450 nm測每孔的吸光度（A）值。

3.4 檢測細胞SOD 活性 首先，用蛋白酶抑制劑PMSF+RAPI 法提取細胞蛋白樣品，用BCA 法測蛋白濃度，再按照SOD 試劑盒使用說明步驟對試劑反應液進行配制和添加，水浴鍋37 ℃孵育30 min 后立即在酶標儀450 nm 處測定A值，計算SOD 活性。SOD活性（U/mg）=SOD 抑制率/50%×反應體系稀釋倍數（0.24 mL/0.02 mL）/待測樣品蛋白濃度（mg/mL），SOD 抑制率（%）=[（A對照-A對照空白）-（A測定-A測定空白）］/（A對照-A對照空白）×100%。

3.5 檢測細胞MDA 含量 提取細胞蛋白并測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書滴加反應液，EP 管用針頭刺一小孔，放于水浴鍋95 ℃高溫孵育40 min，流水下沖洗使之逐漸冷卻，離心機2 680×g進行離心15 min，吸取200 μL 上清液在96 孔板中，酶標儀立即測定各管在532 nm處的A值，計算MDA 含量。MDA 含量（nmol/mg）=（A測定-A對照）/（A標準-A空白）×標準品濃度（10 nmol/mL）/待測樣品蛋白濃度（mg/mL）。

3.6 透射電鏡觀察細胞超微結構的變化 用1 mL戊二醛固定液固定細胞，放到4 ℃冰箱過夜。隔日用PBS 放置搖床上洗3 次后，按照1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水、浸透，環氧樹脂812 包埋劑包埋聚合的順序依次進行，然后超薄切片，最后透射電鏡下觀察并拍攝。

3.7 RT-PCR 檢測Nrf2 的mRNA 表達 使用Trizol法提取細胞總RNA。將RNA 逆轉錄成cDNA，然后進行PCR 擴增。擴增結束用2.0%瓊脂糖凝膠對其進行電泳，然后全自動凝膠成像系統曝光成像半定量分析。Nrf2 的上游引物序列為5'-GAAAAGAAGTGGGCAACTGTGG-3'，下游引物序列為5'-GGTGGGATTTGAGTCTAAGGAGGT-3'，擴增產物長度為117 bp；內參照GAPDH 的上游引物序列為5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，下游引物序列為5'-GAATGTGGATAGGCTGGCGA-3'。

3.8 Western blot 檢測Nrf2 蛋白表達 造模結束后立即按照VPMSF∶VRAPI裂解液=1∶100 配制裂解混合液，冰上裂解細胞30 min 后收集6 孔板裂解液，超聲后離心收集細胞上清液并用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后金屬孵育器（100 ℃）孵育10 min變性。依次經電泳儀電泳，轉膜（濕轉）、10%脫脂牛奶封閉2 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween 20 （TBST）洗膜3次，Nrf2 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。TBST 充分洗滌后，Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，滴加適量ECL 發光液（VA液∶VB液=1∶1），用化學發光成像系統進行曝光拍攝，半定量分析。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 9 統計軟件進行數據分析。所有計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。數據服從正態分布，則多組樣本均數間的比較使用單因素方差分析評估統計意義；否則，使用Kruskal-Wallis檢驗來評估統計學意義。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫熒光標記法鑒定AECII

用免疫熒光標記法檢測AECII 的特異性表達標志物SP-A。熒光顯微鏡觀察結果顯示：藍色熒光為細胞核，紅色熒光為SP-A蛋白位置，定位于AECII細胞核周邊，證實本實驗細胞為AECII，見圖1。

Figure 1. Identification of type II alveolar epithelial cells. Blue arrow： nucleus； yellow arrow： surfactant protein A（SP-A）.圖1 免疫熒光標記法鑒定II型肺泡上皮細胞的結果

2 CCK-8檢測AECII活力

與C組比較，其余四組細胞的A值可見顯著下降（P＜0.05）；與HR 組比較，RA 組的A值顯著升高（P＜0.05）；與RA 組比較，HX 組的A值顯著降低（P＜0.05）；而HR、HD 和HX 三組兩兩相比，A值無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

Figure 2. The changes of absorbance value in all groups. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05 vs C group； #P＜0.05 vs HR group； *P＜0.05 vs RA group.圖2 CCK-8檢測結果

3 免疫熒光標記法檢測AECII中RXRα表達

與C組相比，其余四組細胞中的RXRα含量顯著增加（P＜0.01）；與HR 組相比，RA 組的RXRα含量增加（P＜0.01）；與RA 組對比，HX 組細胞的RXRα含量顯著降低（P＜0.01）；而HR、HD、HX 三組兩兩相比，細胞中RXRα含量無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

Figure 3. The RXRα expression was detected by immunofluorescence staining （scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=5. ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group；**P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖3 免疫熒光標記法檢測RXRα表達結果

4 AECII中的SOD活性和MDA含量

與C 組相比，HR、HD、RA 和HX 這4 組在相應處理后細胞的SOD 活性均下降（P＜0.05），而此4 組細胞MDA 的表達上升（P＜0.05）；與HR 組相比，RA 組的SOD 活性增高（P＜0.05），而MDA 表達下降（P＜0.05）；與RA 組相比較，HX 組細胞的SOD 活性減少（P＜0.05），細胞中MDA 表達增加（P＜0.05）；而HR、HD 和HX 三組兩兩相比，SOD 活性及MDA 含量的變化無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Changes of SOD activity （A） and MDA content （B） in each group. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05 vs C group； #P＜0.05 vs HR group； *P＜0.05 vsRA group.圖4 SOD活性和MDA含量檢測結果

5 透射電鏡觀察AECII超微結構

透射電鏡下看見，C組肺泡細胞結構未見明顯異常，可見豐富的板層小體；與C 組相比，剩余四組肺泡細胞內部可見結構出現不同程度的紊亂。其中HR、HD 和HX 三組AECII 內線粒體發生高度腫脹，線粒體嵴線溶解甚至消失，偶見變異性的增生，板層小體變性，出現空泡化現象；RA 組相較于HR、HD 和HX三組，AECII損傷減弱，板層小體數目增多且空泡化現象減少，線粒體結構相對較為完整，線粒體僅出現輕微腫脹且線粒體嵴清晰。見圖5。

Figure 5. Ultrastructure of the cells under electron microscope.n=5. Scale bar=0.5 μm. The yellow arrow indicates mitochondria， and the blue arrow indicates lamellar bodies.圖5 透射電鏡觀察結果

6 AECII中Nrf2表達

RT-PCR 檢測結果顯示，與C 組相比，HR、HD、RA 和HX 這四組的Nrf2 mRNA 表達均顯著減少（P＜0.01）；與HR和HD組相比，RA組的Nrf2 mRNA表達顯著增加（P＜0.01）；與RA 組相比，HX 組表達下降（P＜0.01）；HR、HD 和HX 三組兩兩相比，各組細胞Nrf2 mRNA表達改變無顯著差異（P＞0.05），見圖6。

Figure 6. The mRNA expression of Nrf2 in each group. Mean±SD. n=5. ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group； **P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖6 RT-PCR檢測結果

與C 組相比，剩余四組細胞中Nrf2 蛋白的表達下降（P＜0.05）；與HR 和HD 組相比，RA 組的Nrf2 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與RA 組相比，HX 組表達下降（P＜0.01）；HR、HD 和HX 三組兩兩相比，Nrf2蛋白表達變化無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

Figure 7. The protein expression of Nrf2 in each group. Mean±SD. n=5. ▲P＜0.05， ▲▲P＜0.01 vs C group； ##P＜0.01 vs HR group； **P＜0.01 vs HD group； △△P＜0.01 vs RA group.圖7 Western blot檢測結果

討 論

氧化應激反應是肺缺血再灌注損傷重要的發生機制，其產生病理性損害的直接原因是ROS的積聚，ROS 是一種高度不穩定的氧分子，肺內大量自由基的增加，使導致肺細胞結構以及功能的異常，伴隨細胞通透性增加、腫脹甚至溶解壞死，肺毛細血管通透性異常，大量組織液無法及時被系統吸收，最終發展為肺水腫[11］。在病理條件下，大量自由基的迅速堆積引起自由基清除系統超負荷工作而被迫＂癱瘓＂，必然引起細胞的損傷[12］。目前研究認為，Nrf2 在細胞介導的抗氧化應激防御反應中發揮著不可或缺的重要作用[13］。另外， SOD是一種抗氧化酶，在氧化應激反應的緩沖中占有關鍵地位，具有清除ROS 的特殊功能。機體發生氧化應激反應時，抗氧化機制無法滿足機體的正常運轉需求，必然造成脂質過氧化反應，從而生成降解產物MDA，引起細胞結構的損傷[14］。MDA的含量也可以反映機體內脂質氧化的程度。本實驗通過測定細胞SOD、MDA 和Nrf2 來檢測細胞損傷程度，結果表明，與C 組比較，HR、HD、RA和HX 四組的MDA 含量均升高，SOD 活性和Nrf2 mRNA 及蛋白表達水平均下降。另外，細胞活力呈下降趨勢，細胞超微結構也發生損傷性改變，表明缺氧/復氧作為誘因引發了氧化應激反應，最終導致大鼠AECII損傷性改變。

RXR 是細胞核激素受體超家族中的重要成員之一，已經證實RXR 是由位于人類9 號染色體（RXRA，又稱NR2B1）、6號染色體（RXRB、NR2B2）和1號染色體（RXRG，NR2B3）三個不同基因編碼[15］。RXR 可以與甲狀腺素受體（thyroid hormone receptor， TR）、維生素D 受體（vitamin D receptor， VD）等受體結合形成二聚體，發揮不同的生物學效應。RXRα作為其重要的分型之一，廣泛表達于多個臟器，參與多種疾病的發生發展。RXRα的抗氧化應激效應，維護細胞穩定等特性已被得到證實[6］。本實驗通過運用RXR 激動劑9-RA 和RXR 拮抗劑HX531 來干預，結果顯示，與HR、HD 和HX 組相比，RA 組的MDA 含量顯著降低，SOD 活性、Nrf2 mRNA 及蛋白表達水平升高，細胞活力上升，細胞損傷程度減輕。而在應用RXR 拮抗劑HX531 后，上述作用被成功阻斷。這些結果證明激動RXR 在一定程度上可通過抑制氧化應激反應，對HR損傷的大鼠AECII起到一定保護作用。

綜上所述，HR 可加劇大鼠AECII 的氧化應激反應，而激動RXR 在一定程度上減輕了大鼠AECII 的HR 損傷，提示其機制可能與抑制氧化應激反應有關。本研究為在體肺缺血/再灌注損傷的防治提供了新的有效干預靶點。