溫胃陽(yáng)湯對(duì)功能性消化不良大鼠肥大細(xì)胞活化及SCF/c-Kit信號(hào)通路的影響*

稅典奎， 黎舒婷， 黃慧花， 龍海華， 楊 健， 羅詩(shī)雨， 覃凌娜

[1柳州市中醫(yī)醫(yī)院（柳州市壯醫(yī)醫(yī)院），廣西 柳州 545001；2柳州市柳鐵中心醫(yī)院，廣西 柳州 545007］

功能性消化不良（functional dyspepsia， FD）是臨床中常見的功能性胃腸病，嚴(yán)重影響人類工作和生活。目前，F(xiàn)D 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，胃腸動(dòng)力障礙被認(rèn)為是基本的病理機(jī)制之一，十二指腸異常是對(duì)FD發(fā)病機(jī)制的新認(rèn)識(shí)[1-2］。肥大細(xì)胞（mast cell， MC）是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可有效調(diào)節(jié)胃腸神經(jīng)，MC活性因子可引起胃腸動(dòng)力障礙及感覺異常。以往研究表明，干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）/受體酪氨酸激酶c-Kit 通路是緩解FD 的有效途徑[3］。本課題組一直致力于FD 的發(fā)病機(jī)制和中醫(yī)藥治療策略研究，曾研制出的溫胃陽(yáng)湯（Wenweiyang decoction，WWYD）被證明對(duì)胃動(dòng)力低下大鼠具有良好的促胃動(dòng)力作用[4］，然而目前基于該方劑治療FD 的作用機(jī)制尚未明了。本研究將探討WWYD 對(duì)FD 大鼠十二指腸黏膜下肥大細(xì)胞及SCF/c-Kit 信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步揭示該方改善FD大鼠胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 5周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（206.9±5.8） g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0014。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件[恒溫（20～26）℃、12 h 明暗交替］下飼養(yǎng)7 d，所有動(dòng)物均自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循柳州市中醫(yī)醫(yī)院（柳州市壯醫(yī)醫(yī)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)，審批號(hào)為2020JAN-KY-YN-003-01。

1.2 藥物 WWYD 組成：桂枝12 g、紅參12 g、法半夏9 g、炮姜10 g、砂仁6 g、茯苓20 g、紫蘇梗10 g、厚樸15 g、草豆蔻6 g、益智仁15 g，藥材為顆粒劑，用純凈水配成所需濃度的混懸液。鹽酸雷尼替丁膠囊ranitidine hydrochloride capsule， RHC）購(gòu)自廣東恒健制藥公司（批號(hào)H44021173）。

1.3 主要試劑 ELISA 試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；兔抗GAPDH 抗體（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGAA002）；兔抗c-Kit 抗體（Abclonal，A0357）；兔抗SCF 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，26582-1-AP）；Western blot 檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，KGP1201）；Trizol（Invitrogen，15596-026）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（TaKa-Ra，RR036B）。

2 主要方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 將所有大鼠隨機(jī)分為6 組，即空白（control）組、模型（model）組、陽(yáng)性對(duì)照RHC組、低劑量WWYD（low-dose WWYD， WWYD-L）組、中劑量WWYD（medium-dose WWYD， WWYD-M）組和高劑量WWYD（high-dose WWYD， WWYD-H）組，每組10 只。除control 組外，其余各組大鼠采用夾尾刺激加不規(guī)則喂養(yǎng)復(fù)合番瀉葉建立FD 模型[5］：不規(guī)則飲食法，單日進(jìn)食，雙日禁食不禁水，普通飼料喂養(yǎng)；用蝴蝶夾夾住大鼠尾巴后1/3，每日夾2 次，一次30 min；同時(shí)每日灌胃番瀉葉，10 mL/kg，連續(xù)灌胃7 d 進(jìn)行造模。control 組和model 組大鼠灌胃生理鹽水，WWYD-L、WWYD-M、WWYD-H 和RHC 組大鼠則分別用WWYD（0.743 g/mL、1.485 g/mL、2.970 g/mL）及鹽酸雷尼替丁膠囊（3 g/L）灌胃，灌胃量均為10 mL/kg。各組大鼠每日定時(shí)灌胃，連續(xù)7 d。

2.2 標(biāo)本采集 十二指腸組織分離腸系膜，剪去組織周邊多余脂肪，將幽門至回盲部的腸管取出，輕拉成直線，置于白紙上，拍照記錄。十二指腸組織縱剪剖開，清洗干凈，一半組織放入-80 ℃保存，一半組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。

2.3 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 造模給藥結(jié)束后，將大鼠斷食不斷水24 h，每只灌胃3 g 營(yíng)養(yǎng)糊，30 min 后處死，打開腹腔，剪取整個(gè)小腸，分離腸系膜，將幽門至回盲部的腸管取出，輕拉成直線，置于白紙上，此長(zhǎng)度即為小腸總長(zhǎng)度，幽門到碳墨前端的長(zhǎng)度為碳墨在小腸內(nèi)前行的距離。小腸推進(jìn)率（%）=碳墨在小腸推進(jìn)的距離/小腸總長(zhǎng)度×100%。

2.4 甲苯胺藍(lán)染色觀察FD 大鼠MC 及MC 脫顆粒數(shù)目 取十二指腸組織切片，常規(guī)脫蠟，放入0.5%甲苯胺藍(lán)溶液中，95%乙醇分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片中MC形態(tài)并計(jì)數(shù)。在100倍視野下采集3個(gè)視野，進(jìn)行肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.5 ELISA 測(cè)定肥大細(xì)胞類胰蛋白酶（mast cell tryptase， MCT）和組胺（histamine， HA）的含量 腹主動(dòng)脈采血法取血，取離心后上清液，采用ELISA 試劑盒檢測(cè)MCT 和HA 含量，讀取各孔的吸光度（A）值，以此計(jì)算樣本濃度。

2.6 RT-qPCR 檢測(cè)SCF 和c-Kit mRNA 表達(dá) 提取十二指腸組織中總RNA，按試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40 個(gè)循環(huán)；監(jiān)測(cè)熔解曲線。記錄樣本擴(kuò)增反應(yīng)的Ct 值，采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測(cè)SCF 和c-Kit 蛋白表達(dá) 取適量十二指腸組織，提取蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。常規(guī)制SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠，上樣、電泳，濕法電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入SCF（1∶500）、c-Kit（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體，4 ℃搖床孵育過夜。取出后，TBST 洗10 min×3 次，室溫?fù)u床孵育相應(yīng)Ⅱ抗（1∶1 000）2 h，洗膜。顯色后，使用Gel-Pro32 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.8 免疫組化法觀察SCF 和c-Kit 蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟、水合、抗原修復(fù)、滅活酶、封閉、滴加Ⅰ抗50～100 μL，4 ℃過夜。PBS 浸洗3 min×3 次，滴加羊抗鼠聚合物50 μL，室溫濕盒孵育20 min。PBS 浸洗3 min×3 次，DAB 顯色，蘇木素染液復(fù)染、脫水封片，數(shù)字病理切片掃描儀掃片觀察SCF 和c-Kit蛋白表達(dá)位置。結(jié)果判斷：顯微鏡下胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為陽(yáng)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析；如樣本資料不符合方差分析的條件，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)）。相關(guān)性比較采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 WWYD對(duì)大鼠小腸推進(jìn)率的影響

與control 組比較，model 組大鼠的小腸推進(jìn)率顯著下降（P＜0.01）；與model 組相比，WWYD-L 組、WWYD-M 組、WWYD-H 組和RHC 組大鼠的小腸推進(jìn)率均顯著提高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of Wenweiyang decoction （WWYD） on small intestine propulsion rate in rats. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs model group.圖1 溫胃陽(yáng)湯對(duì)大鼠的小腸推進(jìn)率的影響

2 WWYD 對(duì)大鼠十二指腸黏膜組織肥大細(xì)胞數(shù)量及MCT和HA含量的影響

與control 組比較，model 組大鼠十二指腸組織中MC 數(shù)量顯著增加（P＜0.05），MCT 和HA 含量顯著升高（P＜0.01）；與model 組比較，WWYD-L 組、WWYDM 組和WWYD-H 組大鼠十二指腸組織中MC 數(shù)量顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），MCT 和HA 含量均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effects of Wenweiyang decoction （WWYD） on mast cell counts and mast cell tryptase （MCT） and histamine （HA） content in rat duodenal mucosa tissues. A： morphological manifestations of mast cells （toluidine blue staining， scale bar=100 μm）and total number of mast cells； B： MCT content； C： HA content. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖2 溫胃陽(yáng)湯對(duì)大鼠十二指腸黏膜組織肥大細(xì)胞數(shù)量及肥大細(xì)胞類胰蛋白酶和組胺含量的影響

3 WWYD 對(duì)大鼠十二指腸SCF 和c-Kit mRNA 水平的影響

與control 組相比，model 組大鼠十二指腸組織SCF 和c-Kit 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與model 組相比，WWYD-M 組、WWYD-H 組和RHC組大鼠十二指腸組織c-Kit和SCF的mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），見圖3。

Figure 3. Effects of Wenweiyang decoction（WWYD） on the mRNA expression of SCF（A） and c-Kit （B） in rat duodenum. RHC：ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs model group.圖3 溫胃陽(yáng)湯對(duì)大鼠十二指腸SCF和c-Kit mRNA表達(dá)的影響

4 WWYD 對(duì)大鼠十二指腸SCF 和c-Kit 蛋白水平的影響

與control 組比較，model 組大鼠十二指腸組織中c-Kit 和SCF 蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01）；與model 組比較，WWYD-M 組、WWYD-H 組及RHC 組大鼠十二指腸組織c-Kit和SCF蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），WWYD-L 組c-Kit 和SCF蛋白表達(dá)升高，但差異不顯著（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Effects of Wenweiyang decoction（WWYD） on the protein expression of SCF and c-Kit in rat duodenum. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖4 溫胃陽(yáng)湯對(duì)大鼠十二指腸SCF和c-Kit蛋白表達(dá)的影響

5 WWYD 對(duì)大鼠十二指腸SCF 和c-Kit 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，model組大鼠十二指腸組織中SCF和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較control組顯著減少[（69±13）vs（101±9）/5 個(gè) 高 倍 鏡 視 野，（64±8）vs（97±11）/5個(gè)高倍鏡視野，P＜0.05］，WWYD-H組SCF和c-Kit 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較model 組顯著增加[（91±12）vs（69±13）/5 個(gè)高倍鏡視野，（80±13）vs（64±8）/5 個(gè)高倍鏡視野，P＜0.05］，見圖5。

Figure 5. Effects of Wenweiyang decoction （WWYD） on the numbers of SCF （A） and c-Kit （B） positive cells in rat duodenum （immunohistochemical staining， scale bar=100 μm）. RHC： ranitidine hydrochloride capsule. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs model group.圖5 溫胃陽(yáng)湯對(duì)大鼠十二指腸SCF和c-Kit蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量的影響

6 相關(guān)性分析

小腸推進(jìn)率分別與MCT 和HA 含量呈負(fù)相關(guān)，與SCF 和c-Kit 的表達(dá)呈正相關(guān)（r值分別為-0.482、-0.450、0.750 和0.742，P＜0.05）；SCF 和c-Kit 與MCT和HA不存在相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。

討 論

FD 癥狀反復(fù)、病情遷延難愈，久病易傷陽(yáng)。本實(shí)驗(yàn)采用夾尾刺激加不規(guī)則喂養(yǎng)復(fù)合番瀉葉法建立大鼠FD 模型，其中夾尾刺激加不規(guī)則喂養(yǎng)是經(jīng)典的FD造模方法[6］，《脾胃論·飲食勞倦所傷始為熱中論》云：“苦寒之藥損其脾胃”，番瀉葉性味苦寒，苦寒瀉下傷脾陽(yáng)引起脾胃虛寒。WWYD 集溫陽(yáng)、益氣、化濕、祛痰、理氣多法于一方，可使中焦脾胃和小腸得以溫運(yùn)，脾胃納運(yùn)復(fù)常，腸氣通暢，諸病證自除。

SCF 又稱MC 生長(zhǎng)因子，是c-Kit 的配體。c-Kit作為肥大細(xì)胞標(biāo)志性蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)c-Kit與SCF 結(jié)合時(shí)，可被迅速磷酸化，激活下游一系列信號(hào)分子，這些信號(hào)分子調(diào)節(jié)MC 的增殖、生長(zhǎng)和活化[7］。在十二指腸部位，肥大細(xì)胞作為免疫炎癥細(xì)胞，SCF 促進(jìn)腸道MC 增生，MC 活化可釋放多種介質(zhì)，如組胺、5-羥色胺和類胰蛋白酶等，引起胃、十二指腸的炎癥反應(yīng)[8-9］。治療FD 的有效方法包括質(zhì)子泵抑制劑、H2 受體拮抗劑和促胃腸動(dòng)力藥等，本實(shí)驗(yàn)選用雷尼替丁作為陽(yáng)性對(duì)照藥，其作為組胺H2 受體拮抗劑，能夠直接作用于MC，從而抑制組胺等所致組胺效應(yīng)，緩解炎癥反應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)顯示通過下調(diào)MC 表面受體c-Kit 及其配體SCF 水平使MC 脫顆粒減少，從而抑制HA釋放[10］。

SCF/c-Kit 通路可以通過調(diào)控Cajal 間質(zhì)細(xì)胞、MC 內(nèi)相關(guān)因子的數(shù)量及結(jié)構(gòu)治療FD[3］，SCF 和c-Kit的低表達(dá)可能導(dǎo)致Cajal 間質(zhì)細(xì)胞缺失并參與胃腸運(yùn)動(dòng)障礙[11］。MC 已被證實(shí)參與FD 發(fā)病過程，然而經(jīng)SCF/c-Kit 通路調(diào)控MC 治療FD 的調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究顯示，經(jīng)高劑量WWYD 給藥后，十二指腸組織中SCF 和c-Kit 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著升高，相應(yīng)的mRNA 水平升高，MCT 和HA 表達(dá)顯著降低，并且小腸推進(jìn)率與SCF 和c-Kit 的表達(dá)呈正相關(guān)，可見WWYD 通過調(diào)節(jié)FD 大鼠十二指腸SCF、c-Kit 及其受體表達(dá)，激活SCF/c-Kit 信號(hào)通路，同時(shí)抑制MCT和HA的生成，從而恢復(fù)大鼠十二指腸動(dòng)力。

既往關(guān)于FD 的研究主要集中于胃的結(jié)構(gòu)功能異常，包括動(dòng)力障礙、敏感性增高及順應(yīng)性下降等，前期研究證明WWYD 在治療FD 中促胃動(dòng)力作用顯著[12］。最近的研究表明，十二指腸因素（如酸、膽鹽、微生物群以及肥大細(xì)胞活化）可能與胃腸感覺運(yùn)動(dòng)功能障礙有關(guān)[8，13］，本研究結(jié)果顯示，給予FD 模型大鼠WWYD 治療后，大鼠的小腸推進(jìn)率顯著提高，進(jìn)一步證實(shí)WWYD 具有促進(jìn)大鼠十二指腸動(dòng)力的作用。十二指腸黏膜伴有輕微的嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)及脫顆粒增加[13-14］，十二指腸病理學(xué)的識(shí)別有望成為治療FD 新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)初步完成MC 計(jì)數(shù)以及MCT 和HA 的自發(fā)釋放水平檢測(cè)，今后的研究將檢測(cè)MC 釋放炎癥因子，如白細(xì)胞介素10（interleukin-10， IL-10）、IL-1β、IL-6 等的水平，進(jìn)一步揭示W(wǎng)WYD 改善十二指腸微炎癥的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究首次證實(shí)WWYD 能夠激活SCF/c-Kit信號(hào)通路，抑制肥大細(xì)胞活化，促進(jìn)大鼠十二指腸動(dòng)力，為FD等相關(guān)胃腸動(dòng)力疾病提供了參考。本實(shí)驗(yàn)表明，小腸推進(jìn)率與MCT 和HA 含量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明肥大細(xì)胞活化過程參與大鼠十二指腸運(yùn)動(dòng)，而SCF 和c-Kit 與MCT 和HA 不存在相關(guān)關(guān)系，提示FD大鼠中十二指腸肥大細(xì)胞活化可能與其他通路相互影響發(fā)揮促十二指腸動(dòng)力作用，還需進(jìn)一步研究。