脂多糖誘導年輕小鼠骨髓及脾臟造血干細胞衰老表型的作用研究*

白 可， 鄒 密， 詹 薔， 黃穎欣， 鞠振宇， 陳陟陽

（暨南大學教育部再生醫學重點實驗室，衰老與再生醫學研究院，生命科學技術學院，廣東 廣州 510632）

造血干細胞（hematopoietic stem cells， HSCs）具有自我更新及多潛能分化能力，可以產生所有成熟的血液細胞，對整個生命時長的造血系統及免疫系統的穩態維持起到重要作用[1］。在下游成熟細胞減少的缺血應激壓力條件下，為滿足機體對成熟血液細胞的需求，造血干細胞進行應激造血以維持血液系統的穩態平衡[2］。脾臟作為髓外重要的造血器官，脾臟介導的骨髓外造血對緩解應激造血具有重要作用[3-4］。炎癥刺激導致血液和免疫系統出現一系列的反應，固有免疫和適應性免疫的先后激活促進炎癥的消除，同時伴隨著大量成熟血液細胞的損失，造血干細胞隨即啟動應激造血以滿足機體的需求[5-6］。有研究報道，造血干細胞表達多種炎癥因子受體，提示除了被動響應下游成熟血液細胞損失的負反饋調控以外，造血干細胞可以直接對炎癥進行反應應答[7-8］。慢性炎癥累積是衰老的重要特征，造血干細胞應對炎癥的應答及炎癥對造血干細胞衰老的影響有待進一步研究。LPS 作為一種常見的細菌內毒素，具有易于使用，模型重現性好，反應機制明確的特點，因此被作為構建炎癥模型的金標準試劑[9］。本研究應用LPS誘導的急性炎癥小鼠模型，旨在探究急性炎癥刺激對骨髓及脾臟中造血干/祖細胞的影響。并初步探索了LPS 誘導的急性炎癥反應與造血干/祖細胞衰老之間的關系，以期為拓寬靶向干預炎癥信號延緩衰老的策略提供參考。

材 料 和 方 法

1 動物

年輕小鼠以及年老小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號為SCXK（京）2021-0006，引進并飼養繁殖于暨南大學實驗動物中心SPF 級屏障環境SYXK（粵）2017-0174，雌雄及數量不限，2～24 月齡，所有小鼠均為C57BL/6J 品系。本實驗已獲得暨南大學動物實驗中心倫理委員會批準，并嚴格按照動物使用原則執行。

2 主要儀器和試劑

流式細胞分析儀（BD，Fortessa）；流式細胞分選儀（BD，Aria III）。流式細胞實驗相關抗體： Biotin-Gr1（13-5931-86），Biotin-CD11b（101204），Biotin-B220（103204），Biotin-CD4（100508），Biotin-CD8（100704），FITC-CD4（100510），FITC-CD8（100706），FITC-B220（48-0452-82），APC-Cy7-CD11b（A15390），PE-Cy7-Sca-1（122514），PE-CD150（115927），APC-c-Kit（17-1171-83），APC-Cy7-SA（405208），PE-CD45（11-0459-42），FITC-Ki67（11-5698-82）購自Thermo Fisher； BV510-CD48 （563536） ， BV605-CD150（567309） 購自BD Biosciences；脂多糖（PA173178）購自Thermo Fisher；紅細胞裂解液（555899）購自BD Pharmingen；胎牛血清（FSP500）購自ExCellbio；DAPI（D9542-10MG）購自Sigma；BD Cytofix/Cytoperm buffer （554714）購自BD Biosciences。

3 主要方法

3.1 小鼠體內急性炎癥模型的建立 參考前期發表的文章[10］，腹腔注射LPS 進行建模，LPS 注射劑量為1.5 mg/kg。對照組腹腔注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。建模成功后的小鼠分為PBS 對照組、LPS 刺激3 h、6 h、16 h、24 h、96 h、168 h組，共七組，每組3～5只。

3.2 小鼠骨髓中造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cells， HSCPs）分析參考已發表的文章[11-12］，小鼠頸椎脫臼犧牲，取小鼠小腿骨、大腿骨、髂骨及脊柱，使用研杵擠壓骨頭釋放骨髓細胞。按照1×108/mL 的細胞密度使用染色緩沖液（1×PBS+2%胎牛血清）重懸細胞，從中取1×107全骨髓細胞置于U 型底96 孔細胞培養板中。每孔加入10 μL Lin抗體混合物[生物素標記的lineage 細胞抗體組合，生物素（biotin）分別與CD4、CD8、B220、Ter119、CD11b和Gr1 偶聯的抗體用于標記HSPCs］，冰上避光孵育30 min。每孔加200 μL 染色緩沖液后離心（288×g、4 ℃離心5 min），棄上清，30 μL 染色緩沖液重懸細胞。按照表1 進行其他表面標記抗體染色，冰上避光孵育30 min。用300 μL染色緩沖液重懸細胞并轉移至流式管中，使用流式細胞分析儀（BD Fortessa）分析。上機前加入0.3 μL 1 g/L 濃度的DAPI 進行染色，使用FlowJo 10軟件處理流式細胞數據。

表1 骨髓細胞及脾臟細胞HSPC流式染色方案Table 1. Flow cytometry staining protocol for bone marrow and splenic HSPCs

3.3 小鼠脾臟中造血干/祖細胞分析 小鼠頸椎脫臼犧牲后，取出小鼠脾臟置于PBS 中。使用5 mL 注射器的推針器尾部（平底部分）研磨脾臟，按照1×108mL 的細胞密度使用染色緩沖液重懸細胞，從中取1×107脾臟單細胞懸液置于U 型底96 孔細胞培養板中。每孔加入10 μL Lin 抗體混合物，冰上避光孵育30 min。染色緩沖液洗去抗體后，按照表1進行其他表面標記抗體染色，冰上避光孵育30 min。每孔加200 μL 染色緩沖液后離心（288×g、4 ℃離心5 min），棄上清；使用400 μL染色緩沖液重懸細胞并轉移至流式管中，使用流式細胞分析儀（BD Fortessa）分析。上機前加入0.4 μL 1 g/L 濃度的DAPI 進行染色，使用FlowJo 10軟件處理流式細胞數據。

3.4 小鼠外周血和脾臟中各類成熟細胞的分析對小鼠進行深度麻醉后，使用取血針通過眼眶后靜脈叢采集小鼠全血（每只20 μL）。使用U 型底96 孔細胞培養板進行抗體染色。參照表2 每孔加入30 μL抗體混合物，與20 μL全血樣本充分混合后，冰上避光孵育30 min。每孔加入200 μL 1×裂紅緩沖液重懸細胞，在室溫下避光放置5～10 min 完成裂紅處理。200 μL 染色緩沖液重懸細胞后轉移到流式管中，使用流式細胞分析儀（BD Fortessa）進行分析；對于小鼠脾臟中各類成熟細胞的分析，參考3.3 制備小鼠脾臟細胞懸液。取1×107脾臟細胞進行抗體染色，參照表2每孔加入30 μL抗體混合物，在4 ℃避光條件下孵育30 min。每孔加入200 μL 1×裂紅緩沖液重懸細胞，在室溫避光下放置5～10 min 完成裂紅處理。200 μL染色緩沖液重懸細胞后轉移到流式管中，使用流式細胞分析儀（BD Fortessa）進行分析。

表2 外周血和脾臟成熟細胞流式染色方案Table 2. Flow cytometry staining protocol for peripheral blood and splenic mature cells

3.5 細胞周期分析 參考方法3.2，使用針對 Sca-1、c-Kit、Lin/SA 的流式抗體對全骨髓以及脾臟細胞進行染色，以標記HSPCs（Lin-Sca1+c-Kit+， LSK）。抗體標記后的細胞使用BD Cytofix/Cytoperm buffer 進行固定，0.4% Triton X-100 破膜。將固定破膜后的細胞與FITC-Ki67 抗體混合后冰上孵育1.5 h；加入1 μL 1 g/L 濃 度 的DAPI 冰 上 孵 育30 min 后 上 機 分析，使用流式細胞儀（BD Fortessa）分析。

3.6 轉錄組數據分析 基于GSE100425[13］數據集：篩選數據集中同時滿足|log2（fold change）|≥2 和P＜0.01 的基因，分別作為相應處理的差異基因。利用clusterProfiler 對表達變化趨勢相同的差異基因進行GSEA富集分析。

4 統計學處理

應用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析。數據均為至少3 次獨立重復實驗結果，以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用Student'st檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS 誘導骨髓中的造血干細胞數量增多及外周血和脾臟出現髓系分化偏向

構建LPS 誘導的急性炎癥小鼠模型，對年輕小鼠進行腹腔注射LPS （1.5 mg/kg）處理（圖1A），不同時間點取小鼠骨髓進行流式細胞術檢測（圖1B）。與對照組小鼠相比，骨髓中LSK 的百分率在LPS 刺激16 h 顯著升高（P＜0.01），見圖1C。進一步對外周血和脾臟中B細胞、T細胞和髓系細胞（CD11b+）進行分析，結果可見，與PBS對照組相比，LPS刺激24 h小鼠外周血中B 細胞和T 細胞百分率顯著下降（P＜0.01），但髓系細胞顯著上升（P＜0.01），且小鼠脾臟中髓系細胞數目增多（P＜0.05），見圖1D、E。

Figure 1. LPS stimulation resulted in an elevated percentage of HSPCs in bone marrow （BM） and a shift towards myeloid cell production in peripheral blood （PB） and spleen. A. experimental scheme of LPS-induced acute inflammation model in mice.Young （2-month-old） WT mice were injected with LPS （1.5 mg/kg） or PBS. B and C： the percentage of HSPCs （Lin-Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in BM. The ratio of mature cells in PB and the number of mature cells in spleen were analyzed by FACS. Representative FACS files （B） and histograms （C） showing the percentage of LSKs in BM at the indicated time points post LPS treatment. D： the percentage of B cells （B220+）， T cells （CD4+ CD8+） and myeloid cells （CD11b+） in PB of young（2-month-old） WT mice with or without LPS treatment. E： the number of B cells， T cells and myeloid cells in spleen was analyzed by FACS. Mean±SD. n=3～11. *P＜0.05， ** P＜0.01 vs PBS group.圖1 LPS誘導骨髓造血干/祖細胞及外周血和脾臟髓系細胞增多

2 LPS對小鼠脾臟髓外造血的影響

與PBS 組相比，LPS 刺激24 h 小鼠脾臟變大（圖2A）。稱重及細胞計數的結果顯示，LPS 組小鼠脾臟重量顯著增多（P＜0.01），脾臟細胞數目增多（P＜0.05），見圖2B、C。對年輕小鼠進行腹腔注射LPS（1.5 mg/kg）之后，在不同時間點檢測脾臟中造血干/祖細胞的百分率。結果顯示，與PBS 對照組相比，LPS 刺激誘導小鼠脾臟中LSK 的百分率升高（P＜0.05），見圖2D。

Figure 2. LPS induced extramedullary hematopoiesis in spleen of young mice. A： picture showed the size of spleen from mice after LPS （right， 1.5 mg/kg） or PBS （left） injections； B： weight of spleens； C： the bar graph showed the number of spleen cells； D： representative FACS files and histogram showing the percentage of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in spleen at the indicated time points after LPS exposure （1.5 mg/kg）. Mean±SD. n=3～11. *P＜0.05， **P＜0.01 vs PBS group.圖2 LPS刺激促進小鼠脾臟髓外造血

3 LPS對骨髓和脾臟中造血干/祖細胞增殖的影響

細胞周期分析結果顯示，在穩態下，年輕小鼠骨髓和脾臟中的LSK 絕大多數處于G0和G1期；我們對脾臟中LSK 的增殖情況進行分析，流式細胞術結果顯示，穩態下，脾臟中的LSK 多處于G1期；與PBS 對照組相比，LPS 刺激促進脾臟中LSK 的增殖（P＜0.05），見圖3A。同時，與PBS 對照組相比，LPS 刺激6 h和24 h，骨髓中處于S-G2-M 期的LSK 百分率顯著升高（P＜0.01），與之對應，處于G0 期的LSK 百分率顯著降低（P＜0.01），見圖3B。通過流式細胞術對脾臟中LSK 的CD45 蛋白表達進行分析，結果顯示，與PBS 對照組相比，LPS 刺激24 h 后CD45 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖3C。

Figure 3. LPS promoted proliferation of HSPCs in the BM and spleen. A： representative FACS files and bar graphs showing the cell cycle status of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） in spleen； B： representative FACS files and bar graphs showing the cell cycle status of LSKs in BM； C： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of CD45high and CD45low LSKs in spleen. Mean±SD. n=4. *P＜0.05， **P＜0.01 vs PBS group.圖3 LPS刺激促進骨髓和脾臟造血干/祖細胞增殖

4 衰老對小鼠脾臟髓外造血的影響

與年輕小鼠相比，24 月齡的年老小鼠脾臟變大（圖4A）。稱重及細胞計數的結果顯示，與年輕小鼠相比，老年小鼠的脾臟重量顯著升高（P＜0.05），脾臟細胞數目無顯著差異（P＞0.05），見圖4B、C。對2 月齡的年輕小鼠與24 月齡的年老小鼠脾臟中造血干/祖細胞的分析顯示，與2 月齡年輕小鼠相比，24 月齡的年老小鼠脾臟中的LSK 和HSC（CD48-CD150+LSK）的百分率顯著升高（P＜0.01），見圖4D。

Figure 4. Old mice exhibited extramedullary hematopoiesis in spleen. A： picture shows the size of spleens from young（upper） and old （lower） mice； B： the weight of spleen in young and old mice； C： the total number of cells in spleens from young and old mice； D： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of HSPCs in spleen from young and old mice. Mean±SD. n=3～14. #P＜0.05， ## P＜0.01 vs yong group.圖4 衰老促進小鼠脾臟髓外造血

5 衰老促進骨髓中造血干/祖細胞比例升高及外周血和脾臟出現髓系偏向

使用流式細胞儀檢測2 月齡的年輕小鼠與不同年齡（10月齡、18月齡、24月齡）年老小鼠骨髓中LSK和HSC 的百分率。統計結果顯示與年輕小鼠相比，年老小鼠骨髓中LSK 和HSC 的百分率顯著升高（P＜0.01），見圖5A。進一步針對外周血及脾臟的流式細胞分析結果顯示，與年輕小鼠相比，年老小鼠外周血中的B 細胞百分率顯著降低（P＜0.01），髓系細胞百分率顯著升高（P＜0.01）；年老小鼠脾臟中的B 細胞百分率顯著降低（P＜0.01），見圖5B。

Figure 5. Old mice exhibited increased percentage of HSPCs in BM and a shift in myeloid cell production in PB and spleen. A： representative FACS files and bar graph showing the percentage of HSPCs （Lin- Sca1+ c-Kit+ cells， LSKs） and HSCs（CD48- CD150+ LSKs） in BM from young and old mice； B： representative FACS files and bar graphs showing the percentage of B cells （B220+）， T cells （CD4+ CD8+） and myeloid cells （CD11b+） in PB and spleen from young （2-month-old）and old （24-month-old） WT mice. Mean±SD. n=3～7. ##P＜0.01 vs young group.圖5 衰老促進骨髓造血干/祖細胞及外周血和脾臟髓系細胞增多

6 LPS處理誘導造血干細胞炎癥、ROS和凋亡信號激活

為了探究炎癥誘導造血干細胞功能損傷的潛在調控機制，我們重新分析了GSE100425[13］數據集中TLR4 和TLR2 炎癥受體激活劑LPS 和Pam3CSK4（Pam3）體內刺激后12 h小鼠造血干細胞的轉錄組變化。針對炎癥刺激誘導的差異基因進行GSEA分析。分析結果顯示，IL-6、TNF-α、INF-γ、TGF-β 及IL-2/STAT5等炎癥信號通路被激活（圖6A），此外，刺激導致氧化應激及凋亡通路富集（圖6B）。

Figure 6. LPS induced activation of inflammatory， ROS and apoptosis signaling in HSCs. A： dot plot showing the up-regulated pathways in HSCs of mice 12 h after LPS and Pam3 treatment； B： gene set enrichment analysis （GSEA） showed that the genes involved in apoptosis pathway were enriched in HSCs of mice 12 h after LPS and Pam3 treatment.圖6 LPS誘導造血干細胞炎癥、ROS和凋亡信號通路激活

討 論

慢性炎癥累積會導致干細胞衰老，進而影響多種組織器官的長期穩態維持。炎癥刺激導致造血干細胞功能受損，損害移植后造血重建能力及誘導髓系偏向分化[14-16］。多數研究以連續炎癥刺激作為切入點研究炎癥累積對造血干細胞功能及衰老的影響[8］，而急性炎癥刺激對造血干/祖細胞的影響仍有待進一步探索。在本研究中，我們應用LPS 刺激模擬細菌炎癥構建急性炎癥小鼠模型，開展了針對小鼠造血干/祖細胞應對炎癥刺激后動態變化的研究。我們的研究顯示，炎癥刺激后短時間內，骨髓造血干/祖細胞展現出迅速的增殖，提示骨髓造血干細胞在第一時間響應LPS刺激。伴隨著LPS刺激，骨髓造血干細胞向脾臟遷移進而促進髓外造血，提示骨髓和脾臟在應對炎癥時協同調控應激造血。有研究提示，炎癥是潛在推動造血干細胞衰老相關功能失調的關鍵因素[17］。本研究中，LPS誘導的急性炎癥反應導致的骨髓造血干/祖細胞增殖、外周成熟細胞髓系分化偏向以及脾臟中的髓外造血等現象與小鼠造血衰老表型非常相似，提示衰老過程中的炎癥累積導致造血系統功能異常。明確炎癥調控造血干細胞功能的具體機制，將為緩解造血干細胞衰老及治療衰老相關血液學疾病提供重要的干預靶點。