Piezo1通道激活促進大鼠冠脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的機制研究*

蔡泳江， 鄭燕湘， 王梓帆， 鄺素娟， 楊 慧， 饒 芳， 鄧春玉，3△

（1南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515；2南方醫科大學附屬廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，醫學研究部臨床藥理重點實驗室，廣東 廣州 510080；3華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006）

Piezo1是一種機械敏感性離子通道蛋白，主要存在于內皮細胞、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）和成纖維細胞等細胞中，能介導Na+、K+、Ca2+和Mg2+等陽離子內流，但對Ca2+具有偏向性[1］。Ca2+是VSMCs 內重要的第二信使，可以激活鈣蛋白酶并調控多種轉錄因子，參與VSMCs 多種生理病理過程。VSMCs 中Ca2+調控方式包括細胞外Ca2+內流和細胞內Ca2+庫的Ca2+釋放。Piezo1 能感應機械力刺激并將機械信號轉化為胞內Ca2+信號，這種鈣信號轉導可參與調控多種心血管生理功能已被明確[2］，而且Piezo1 介導鈣信號失調也與血管病變有關[3-4］。研究表明，Piezo1 介導細胞鈣調控信號與心血管疾病存在密切關系，但是Piezo1 對細胞鈣調節方式的研究報道較少，尤其是促進冠狀動脈平滑肌細 胞（coronary artery smooth muscle cells， CASMCs）內Ca2+濃度升高的作用機制，更鮮為報道。因此，本研究主要在細胞水平上，探究Piezo1 參與調控大鼠CASMCs中Ca2+穩態的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級9～11 周 齡 雄 性SD 大 鼠30 只，體 質 量250～300 g，由廣州銳格生物科技有限公司提供，許可證號為SCXK（粵）2021-0059。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）的動物實驗倫理審查（No. KY-Z-2021-581-01）。

2 主要實驗儀器和試劑

SP5FCS 激光共聚焦顯微鏡（Leica）；LSM900 激光共聚焦顯微鏡和Stemi DV4型體視顯微鏡（Zeiss）；蛋白電泳儀和轉膜儀（北京市六一儀器廠）；LAS500超靈敏化學發光成像儀（GE）。

DMEM 培養液（C11885500BT）、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、0.25%胰蛋白酶-EDTA 和青霉素-鏈霉素均購自Gibco；Piezo1 激動劑Yodal（HY-18723）、Piezo1 抑制劑GsMTx4（HY-P1410A）、鈣庫操縱性鈣通道（store-operated calcium channel，SOCC）抑制劑BTP2（HY-100831）、雷諾丁受體（ryanodine receptor， RyR）抑制劑dantrolene（HY-12542）和1，4，5-三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-triphosphate receptor， IP3R）抑制劑xestospongin C（HY-103312）均購 自MedChemExpress；肌 漿/內 質 網Ca2+-ATP 酶2（sarco-/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2， SERCA2）抑制劑毒胡蘿卜素（thapsigargin， TG； 049M4032V）、L 型 鈣 通 道 抑 制 劑 硝 苯 地 平（nifedipine， Nif；57H1139）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO；015K0151）均購自Sigma；Piezo1抗體（MA5-32876）購自Thermo Fisher；基質相互作用分子1（stromal interaction molecule 1， STIM1）抗體（#5668）和SERCA2抗體（#9580）購自Cell Signaling Technology；GAPDH 抗體（60004-1-lg）、TOM20 抗體（11802-1-AP）和lamin B1 抗 體（112987-1-AP）均 購 自Proteintech；Piezo1siRNA （si-Piezo1）購自廣州銳博生物技術有限公司；STIM1siRNA （si-STIM1）購自上海吉凱基因有限公司；Lipofectamine 3000 （L3000075）購自Invitrogen；其余試劑均為國產分析純。

無鈣臺式液成分（mmol/L）：NaCl 136.00、KC1 5.40、NaH2PO40.33、MgCl2·6H2O 1.00、D-glucose 10.00 和HEPES 10.00，用NaOH 調 整pH 至7.35～7.40；含2 mmol/L Ca2+臺式液成分（mmol/L）：CaCl22.00、NaCl 136.00、KC1 5.40、NaH2PO40.33、MgCl2·6H2O 1.00、D-glucose 10.00 和HEPES 10.00，用NaOH調整pH至7.35～7.40。

3 實驗方法

3.1 原代大鼠CASMCs 的獲取及培養 冠狀動脈分離方法參考同實驗室前期發表的文獻[5］。SD 大鼠吸入CO2麻醉后脫臼處死，75%乙醇消毒皮膚后用無菌剪刀和鑷子打開胸腔，取出心臟，放入4 ℃預冷的無菌PBS 溶液中。在生物安全柜內，在體視顯微鏡下使用無菌顯微剪和顯微鑷分離出大鼠心臟的左前降支、右冠脈和間隔支，去除冠脈周圍脂肪和結締組織，在直徑35 mm 皿中加入100 μL DMEM 培養液（含20% FBS和1%雙抗），在培養液中將分離好的冠脈剪碎，長度約0.5 mm，用無菌巴氏管吸取血管懸液，均勻鋪于25 cm2培養瓶內，加入5 mL DMEM 培養液（含20% FBS 和1%雙抗），倒置放于恒溫培養箱，于37 ℃、5% CO2條件下靜置1.5 h。待組織塊貼牢后，培養瓶正常放置，繼續培養。每隔4 d 更換培養液，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長至融合成片達80%后，用0.25%胰酶進行消化傳代，后續使用含10% FBS 和1%雙抗的DMEM 培養液進行細胞培養，將第2～4代細胞用于實驗。

3.2 原代CASMCs 的siRNA 轉染 將第2～4 代的CASMCs 使用Lipofectamine 3000 試劑進行轉染，設置陰性對照（si-NC）組和實驗（si-Piezo1/si-STIM1）組。將125 μL Opti-MEM 培養液與5 μL Lipofectamine 3000 試劑混勻后振蕩5 s，制備Lipofectamine 3000 試劑混合液；再將125 μL Opti-MEM 培養液與5 μL 濃度為20 μmol/L 的siRNA 混合，得到siRNA 混合液；按1∶1 體積比混合Lipofectamine 3000 試劑混合液和siRNA 混合液并吹打均勻，室溫靜置15 min；然后與750 μL 無雙抗的DMEM 培養液（含10% FBS）混合，加入CASMCs中置于培養箱轉染48 h，轉染后的細胞用于鈣離子濃度檢測和Western blot實驗。

3.3 CASMCs 細胞內鈣離子濃度（intracellular Ca2+concentration， [Ca2+］i）檢測 方法如前期研究所示[5］，將CASMCs 種于激光共聚焦專用皿中，接種密度約50%～60%，待細胞貼壁生長48 h，需要轉染處理的細胞按“3.2”進行干預。將貼壁的CASMCs用PBS清洗3 次，吸掉PBS 后每皿依次加入1 mL 含10%FBS 的DMEM 培養液、3 μL 濃度為5 μmol/L 的Fluo-4 AM 鈣離子指示劑（從此開始全程避光操作），37 ℃、5% CO2孵育30 min；根據實驗內容，用無鈣或者含鈣臺式液洗2 遍，每皿加入1 mL 的無鈣或者含鈣臺式液，分別加入實驗所需抑制劑室溫孵育15 min；在激光共聚焦顯微鏡下選取適合的視野，采用xyt模式掃描6 min或15 min，掃描6 min時在1 min加入終濃度為10 μmol/L 的Yoda1，掃描15 min 時分別在1 min 和8 min 加入不同的藥物刺激細胞。實驗結束后分別記錄背景熒光值F0，第一次加藥前的基線熒光值F1，第一次加藥后達到的熒光峰值F2，第二次加藥前的熒光值F3以及之后達到的熒光峰值F4。計算第一次加藥干預后CASMCs 內Ca2+上升程度（F2-F0）/（F1-F0）和第二次加藥干預后CASMCs 內Ca2+上升程度（F4-F0）/（F3-F0）。細胞內Ca2+熒光強度變化曲線使用SigmaPlot 14.0軟件作圖獲得。

3.4 細胞免疫熒光染色 CASMCs培養在激光共聚焦專用皿約48 h，用PBS 清洗3 次，加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后PBS 清洗3 次，加入含0.2% Triton X 的PBS溶液室溫打孔15 min，PBS清洗3 次，再加入含4% BSA 的PBS 溶液室溫封閉30 min，棄去封閉液，加入100 μL 用封閉液稀釋的Ⅰ抗（1∶100），于濕盒內4 ℃孵育過夜。棄去Ⅰ抗后，PBS 清洗3 次，避光條件下加入與Ⅰ抗種屬來源相同的熒光Ⅱ抗溶液（1∶500）室溫孵育1 h，棄去Ⅱ抗，PBS 清洗3 次，加入適量含DAPI 的封片劑使細胞被覆蓋，10 min 后用LSM900 激光共聚焦顯微鏡掃描染色結果。

3.5 Western blot siRNA 處理后的CASMCs 用PBS洗3 次，加入含蛋白酶抑制劑的強RIPA 于冰上裂解30 min，刮下細胞并收集于EP管中，4 ℃、13 500×g離心15 min，收集的上清液為細胞總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液（4× loading buffer）和RIPA，配成等體積等質量的蛋白樣品，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，依次進行SDS-PAGE、轉膜、5%脫脂牛奶封閉、TBST洗滌3次（每次5 min）、Ⅰ抗4 ℃孵育過夜、TBST 洗滌3 次、Ⅱ抗室溫孵育1 h、TBST 洗滌3次和ECL 試劑盒顯影蛋白條帶。最后利用ImageJ 圖像分析軟件進行灰度值結果分析。

4 統計學處理

實驗數據用統計分析軟件SPSS 21.0進行分析，使用GraphPad 9.0 將統計分析結果繪制圖。計量資料以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞免疫熒光染色檢測Piezo1 蛋白在CASMCs中的表達

采用原代細胞培養獲得CASMCs，再進行免疫熒光染色，結果顯示Piezo1在原代培養CASMCs的胞質和胞核中均有所表達，Piezo1蛋白在細胞核周圍的表達較高，見圖1。

Figure 1. Cell immunofluorescence staining showed that Piezo1 was expressed in CASMCs （scale bar=20 μm）.圖1 細胞免疫熒光染色結果顯示Piezo1在CASMCs中表達

2 Piezo1 誘導CASMCs 胞內Ca2+升高與L 型鈣通道無關

如圖2 所示，與DMSO 組相比，Yoda1 （10 μmol/L）組Ca2+熒光強度顯著增加（P＜0.01）；與Yoda1組相比，Yoda1+GsMTx4（3 μmol/L；Piezo1 抑制劑）組Ca2+熒光強度顯著降低（P＜0.01），而Yoda1+Nif（1 μmol/L；L 型鈣通道抑制劑）組Ca2+熒光強度沒有明顯變化。

Figure 2. The changes of intracellular Ca2+ concentration mediated by Piezo1 were not affected by L-type calcium channels.A： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution with 2 mmol/L Ca2+； B： the changes of intracellular Ca2+ concentration in CASMCs stimulated by Yoda1. Mean±SEM. n=111 in DMSO group； n=154 in Yoda1 group； n=152 in Yoda1+Nif group； n=121 in Yoda1+GsMTx4 group.**P＜0.01 vs DMSO group； ##P＜0.01 vs Yoda1 group.圖2 L型鈣通道不參與Piezo1誘導CASMCs胞內Ca2+升高

3 Piezo1 誘導CASMCs 胞內Ca2+釋放與IP3R 和RyR通道無關

無鈣臺式液中加入Yoda1（10 μmol/L），Yoda1組Ca2+熒光強度與DMSO組相比顯著增加（P＜0.01），見圖3A。分別使用IP3R 抑制劑xestospongin C （0.1 μmol/L）和RyR 抑制劑dantrolene （10 μmol/L）抑制IP3R 和RyR 通道，實驗結果表明，與Yoda1 組相比，Yoda1+xestospongin C 組 和Yoda1+dantrolene 組Ca2+熒光強度無明顯變化，見圖3B。

Figure 3. The intracellular calcium release mediated by Piezo1 were not affected by IP3R and RyR calcium channels. A： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution without Ca2+ （n=101 in DMSO group； n=110 in Yoda1 group）； B： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 in Tyrode's solution without Ca2+ after treatment with IP3R and RyR inhibitors （n=109 in Yoda1 group； n=122 in Yoda1+xestospongin C group； n=113 in Yoda1+dantrolene group）. Mean±SEM. **P＜0.01 vs DMSO group.圖3 IP3R和RyR鈣通道不參與Piezo1誘導胞內Ca2+釋放

4 Piezo1 誘導CASMCs 內質網和其它細胞器Ca2+釋放

無鈣臺式液中使用SERCA2 抑制劑TG （2 μmol/L），結果如圖4A～E 所示，第一峰值中TG 引起的Ca2+熒光升高比值明顯高于Yoda1（P＜0.01）；第二峰值中，TG-Yoda1 組Ca2+熒光強度與對照組TG-TG 組相比顯著增加（P＜0.01），Yoda1-TG 組Ca2+熒光強度與TG-TG 組相比顯著增加（P＜0.01）。免疫熒光染色結果顯示，Piezo1 與內質網標志物SERCA2、線粒體外膜標志物TOM20和核膜標志物lamin B1共定位程度較高，見圖4F～H。

5 Piezo1 通過誘導CASMCs 內質網Ca2+耗竭而激活SOCC

如圖5A 所示，與Nif 組相比，Nif+BTP2（10 μmol/L；SOCC抑制劑）組中2 mmol/L CaCl2誘導的Ca2+熒光強度顯著降低（P＜0.01）。敲減STIM1后，Western blot 結果顯示CASMCs 中STIM1 蛋白表達顯著下調（P＜0.01），見圖5B；激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示si-STIM1 組中2 mmol/L CaCl2誘導的Ca2+熒光強度顯著低于si-NC 組（P＜0.01），見圖5C。敲減Piezo1后，si-Piezo1 組蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見圖5D；敲減STIM1后，si-STIM1 組蛋白表達顯著下調（P＜0.01），見圖5E；與si-NC 組相比，si-Piezo1 組中2 μmol/L TG 誘導的Ca2+熒光強度顯著增加（P＜0.05），si-STIM1 組中2 mmol/L CaCl2誘導的Ca2+熒光強度顯著降低（P＜0.01），見圖5F。

6 抑制SOCC 后Piezo1 能誘導CASMCs 胞外Ca2+內流

Western blot 結果顯示，與陰性對照組相比，si-Piezo1 組中Piezo1 蛋白表達顯著減少（P＜0.01），見圖6A。在無鈣臺式液中使用1 μmol/L Nif 和10 μmol/L BTP2 抑制L 型鈣通道和SOCC，與si-NC 組相比，si-Piezo1 組中10 μmol/L Yoda1 和2 mmol/L CaCl2誘導的Ca2+熒光強度顯著降低（P＜0.01），見圖6B。

Figure 6. Piezo1 on cell membrane induced extracellular Ca2+ influx. A： the protein expression of Piezo1 in the CASMCs after knockdown of Piezo1 （n=4）； B： representative fluorescence intensity of CASMCs stimulated by Yoda1 and CaCl2 in Tyrode's solution without Ca2+ after treatment with Nif and BTP2 （n=195 in si-NC group； n=250 in si-Piezo1 group）. Mean±SEM. **P＜0.01 vssi-NC group.圖6 細胞膜上Piezo1誘導細胞外Ca2+內流

討 論

多數機械轉導過程依賴于機械激活的陽離子通道來使細胞內Ca2+濃度升高，導致Ca2+依賴的下游信號通路被激活，進而控制不同的細胞過程和生理反應[6］。Piezo1 作為一種機械敏感性陽離子通道，在心血管系統中充當壓力傳感器[6］，并與多種心血管疾病的發生發展有關。研究表明，Piezo1存在于內皮細胞、VSMCs和成纖維細胞等多種細胞中，它能將機械信號轉化為胞內Ca2+信號，參與細胞的分化、增殖、遷移等生物過程[4，7］。其中，VSMCs 具備感受機械刺激和傳導的能力，它在維持血管完整性和血管重塑方面發揮著重要作用[8］。冠狀動脈是供應心臟血液的血管，位于冠脈中層VSMCs 的收縮狀況是影響冠脈血流量大小的重要因素，Piezo1能將脈管系統中的生物力學轉化為CASMCs 內Ca2+信號，通過Ca2+信號傳導途徑調節血管功能[2，4］，從而影響心臟的供血。因此，選擇探索Piezo1 在CASMCs 中對Ca2+穩態調節的機制對心血管系統研究有重要意義。本研究通過細胞免疫熒光實驗證實，Piezo1存在于原代細胞培養的CASMCs 中，在細胞質和細胞核中均有表達，且在細胞核周圍表達較高，可能是由于Piezo1 廣泛表達于內質網上[9］，而內質網與核膜相互連接所導致。

VSMCs 內Ca2+濃度變化主要包括細胞膜上Ca2+通道誘導細胞外Ca2+內流和細胞內Ca2+儲存器誘導內Ca2+釋放。血管平滑肌功能異常在一定程度上取決于細胞內Ca2+濃度變化[10］，包括Piezo1在內的各種Ca2+通道在維持胞內Ca2+穩態以及調節血管平滑肌興奮性中發揮著重要作用[11］。小分子Yoda1 是Piezo1 的特異性激動劑，可直接與Piezo1 結合，通過改變其構象來激活Piezo1。已有研究證實Yoda1 可以誘導CASMCs 中Ca2+水平升高[5］，但Piezo1 參與CASMCs 的Ca2+濃度調節機制還不太明確。本研究在含鈣臺式液中使用Piezo1 的選擇性抑制劑GsMTx4，結果顯示Yoda1 誘導Ca2+內流顯著減少，證明CASMCs 中Ca2+水平升高是由Piezo1 導致的。L 型鈣通道屬于常見的細胞內外Ca2+交換通道，本研究實驗結果表明Piezo1 誘導CASMCs 中Ca2+水平升高與細胞膜上的L 型鈣通道無關。在無鈣臺式液中加入Yoda1，CASMCs 的Ca2+熒 光 強 度 顯 著 增 加，提 示Piezo1 可以誘導細胞內Ca2+庫的Ca2+釋放。使用Ca2+通道抑制劑后，實驗結果表明Piezo1誘導CASMCs內Ca2+釋放與內質網上的RyR和IP3R無關。

細胞內大部分Ca2+儲存在細胞器中[12］，包括內質網、線粒體和核膜等。內質網上的SERCA2 可以將胞質中Ca2+重新攝回內質網中，使用其阻斷劑TG 可以導致內質網中Ca2+耗竭。本研究實驗結果顯示，在無鈣臺式液中加入TG 引起胞內Ca2+釋放顯著高于Yoda1所誘導的Ca2+釋放，而且加入Yoda1之后TG仍能引起內質網Ca2+釋放，說明Piezo1只能誘導內質網中部分Ca2+釋放；在無鈣臺式液中使用TG 排空內質網中Ca2+后，加入Yoda1 也能顯著引起細胞內Ca2+釋放，說明Piezo1 能誘導細胞內除內質網以外其它細胞器Ca2+釋放。雙標免疫熒光染色結果顯示，Piezo1與CASMCs 中內質網標志物SERCA2、線粒體外膜標志物TOM20 和核膜標志物Lamin B1 的共定位程度較高，表明除內質網以外，Piezo1 也可能誘導線粒體和核膜Ca2+釋放。

SOCC 在心血管疾病的發生發展中起重要作用[13］，它主要由STIM1 和通道蛋白ORAI1 構成。內質網中Ca2+濃度變化信號能被跨膜Ca2+傳感器STIM1所感知，導致位于內質網上的STIM1 遷移至細胞膜與ORAI1 結合，隨后激活SOCC，進而觸發鈣庫操縱性Ca2+內流（store-operated calcium entry， SOCE）[14］。因此，進一步探究Piezo1 誘導CASMCs 內質網Ca2+釋放后是否會導致SOCE 發生。本研究在無鈣臺式液中抑制L 型鈣通道以及使用SOCC 阻斷劑BTP2，實驗結果表明抑制SOCC后Yoda1誘導細胞外Ca2+內流減少；通過敲減STIM1抑制SOCC 的功能，實驗結果再次證明Yoda1 可以誘導細胞膜上SOCE 發生。為了探究Piezo1 誘導SOCE 發生的機制，分別敲減Piezo1和STIM1，并且在實驗中抑制了L 型鈣通道，實驗結果表明敲減Piezo1并不影響TG 誘導的SOCE，提示Piezo1 是通過誘導內質網Ca2+釋放從而激活SOCC，可能不會直接影響SOCC。有研究報道SERCA2 和Piezo1 的相互抑制作用[15］，本研究實驗結果顯示敲減Piezo1后TG 誘導的Ca2+釋放顯著增加，證明了Piezo1 對SERCA2 具有抑制作用。敲減Piezo1并抑制細胞膜上的SOCC 和L 型鈣通道，實驗結果表明細胞膜上Piezo1通道能誘導胞外Ca2+內流。

研究表明Piezo1 介導細胞Ca2+穩態失衡是疾病的重要觸發因素：Piezol 通過升高[Ca2+］i促進肺動脈高壓的進展[9］；高血壓下Piezo1 激活引起細胞內Ca2+調控異常是血栓形成的關鍵[16］；Piezo1 激活調控Ca2+信號傳導加重主動脈瓣鈣化病的發展[17］等。目前大部分研究關注Piezo1 的機械轉導和Ca2+信號調控作用，而Piezo1促進CASMCs鈣濃度增加的機制仍不清楚。研究正常生理狀態下Piezo1 對CASMCs 鈣調節的機制，以及Piezo1 與重要Ca2+通道之間的關系，為疾病狀態Piezo1 導致鈣穩態失衡提供了干預策略。[Ca2+］i增加受離子通道和蛋白的調節，除了常見的Ca2+通道和Ca2+庫，細胞中還有其它更復雜的鈣調節機制，并且在疾病狀態下，Piezo1 是如何感知病理變化進行Ca2+調節仍然未知，因此Piezo1在細胞中鈣調控機制有待更深入的研究。

綜上所述，本研究初步證實Piezo1 激動劑在CASMCs 中誘導細胞外Ca2+內流主要通過細胞膜上Piezo1 通道和間接激活的SOCC，也能觸發胞內細胞器Ca2+釋放，共同增加CASMCs 中[Ca2+］i。這些結果為Piezo1調控細胞Ca2+平衡提供更多可能性。