HOXB4基因表達水平在骨髓增生異常綜合征中的臨床意義

王怡晨 嚴燕雯 宋美慧 薛祥俊 周文廣 李玉權 齊玲 李光華 曾祥宗，

1大理大學基礎醫學院（云南大理 671000）；廣州醫科大學附屬第六醫院，清遠市人民醫院2消化病研究所，3血液病科（廣東清遠 511518）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome， MDS）是一種起源于造血干細胞的異質性髓系腫瘤，以骨髓無效造血、病態造血和高風險向急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）轉變為特征［1］。MDS 的總體2 年生存率約65%［2-3］。其中，20% ～ 30%患者會出現AML 轉化，此時治療難度比原發AML 還要高，中位生存期不到1年［4-5］。MDS 向AML 轉化涉及多種機制，如基因突變、染色體不穩定性、表觀遺傳改變、免疫缺陷及骨髓微環境改變等，但其確切機制尚不明確［6-7］。近來，有文獻［7-8］報道與造血干細胞的自我更新及分化命運相關的轉錄因子在MDS 向急性白血病轉化中扮演著重要角色，如RUNX1、GATA2 等［9-10］。同源盒基因（homeobox gene，HOX）是調控造血干細胞增殖、分化的高度保守的同源域轉錄因子家族。其中，HOXB4 是調控造血干細胞自我更新的重要正向因素［11］。ANTONCHUK 等［12］發現過表達HOXB4 基因可以使得具有造血潛能和分化能力的造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSC）快速增殖。李琳等［13］發現，HOXB4 基因的表達水平與AML 患者腫瘤負荷存在正相關，高表達HOXB4 患者的化療效果差。然而，這些研究主要聚焦在正常造血干細胞的擴增以及腫瘤化療耐藥上，關于HOXB4 基因在MDS 患者中的臨床意義既往少見報道。為此，本研究擬通過檢測MDS 患者骨髓樣本中HOXB4的表達水平，探討其在MDS疾病進展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2021 年7 月至2023 年6 月在廣州醫科大學附屬第六醫院（清遠市人民醫院）血液內科診斷為MDS 患者49 例（MDS 組），其中男26 例，女23 例，年齡25 ～ 82 歲，中位年齡63 歲，按照WHO 2016 分型標準［14］分型。參照修訂版國際預后評分標準［15］（international prognostic scoring system-revised，IPSS-R）對患者進行評分，不伴原始細胞增多類型（none excess blasts， Non-EB）患者25 例，伴原始細胞增多類型（excess blasts，EB）患者24 例。納入同時期就診的35 例非惡性血液系統疾病患者（巨幼細胞性貧血24 例，缺鐵性貧血11 例）作為對照組（C 組），C 組中男16 例，女19 例，年齡24～85 歲，中位年齡59 歲。為進一步探討HOXB4 基因的表達水平與臨床特征的關系，我們根據HOXB4 的中位表達水平分為高表達組和低表達組，其中HOXB4 高表達組24 例，低表達組25 例，參照IPSS-R 對患者進行評分，以4 分為界限劃分為相對低危組和相對高危組。本研究經清遠市人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理審查號：2023-研-135）且患者本人知情同意。

1.2 主要儀器及試劑Ficoll-Paque PLUS 淋巴細胞分離液（美國GE 公司），TRIzol 總RNA 提取試劑（美國Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國BIO-RAD 公司）；通過NCBI查找HOXB4 基因全序列，使用Primer premier 6軟件設計特異性引物（表1）。通過BLAST 比對合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。T100 梯度PCR 儀（美國BIO-RAD 公司）和 CFX96實時熒光定量PCR 儀（美國BIO-RAD 公司），Nano-Drop One 超微量分光光度計（美國賽默飛公司），全自動數字玻片掃描系統（德國ZEISS 公司）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 骨髓單個核細胞的分離使用EDTA 抗凝的采血管采集患者骨髓液4 ～ 5 mL，Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞，用于后續實驗。

1.4 RNA 的提取及cDNA 的合成TRIzol 法提取骨髓單個核細胞中的總RNA，超微量分光光度計測定A260/A280處的吸光度值，記錄吸光度值在1.8 ～2.2 之間的樣本的RNA 濃度，進行cDNA 的合成。逆轉錄按照試劑商提供的說明書進行。取500 ng RNA、1 μL逆轉錄酶、4 μL 5×逆轉錄緩沖液，dd H2O補齊至反應體系20 μL。55 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。待反應結束后將產物置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測HOXB4表達水平實時熒光定量PCR 按照試劑盒說明書進行。iTaq Universal SYBR Green Supermix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總反應體系20 μL，每一份標本做3 個復孔用來檢測。在CFX96 實時熒光定量PCR 儀上進行擴增反應：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s 進行40 次循環，擴增完成后進入溶解曲線程序：65 ℃ 60 s。待所有反應結束后，以GAPDH 為內參，對HOXB4基因的表達水平進行標準化處理。根據Cq 值來計算△Ct 值，基因表達水平根據公式△Ct = Ct（待測基因）-Ct （GAPDH）進行計算，計算結果最終以2-（ΔΔCt）值來代表基因的表達水平。

1.6 統計學方法使用SPSS 21.0 統計分析軟件，連續變量以±s表示，偏態分布資料以M（P25，P75）表示，采用獨立t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，分類變量以n（%）表示，采用Fisher 精確值檢驗或χ2檢驗。以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDS 患者HOXB4 基因表達水平MDS 組骨髓中HOXB4 基因的mRNA 中位表達水平為3.30（1.61，7.80），C 組的HOXB4 基因的mRNA 中位表達水平為1.43（0.61，3.12），與C 組相比，MDS 患者骨髓中HOXB4 基因的mRNA 表達水平顯著升高（Z = -3.307，P= 0.002）。

2.2 HOXB4 基因表達水平與患者臨床特征之間的關系HOXB4 基因高表達組白細胞的水平更低（P= 0.049），中性粒細胞水平有下降的趨勢（P= 0.064），兩組之間血紅蛋白濃度及血小板數量差異無統計學意義（P= 0.342），見表2。

表2 MDS 患者的臨床特征Tab.2 Clinical characteristics of patients with MDS

2.3 HOXB4 的mRNA 表達水平與MDS 分型的關系HOXB4 高表達組患者具有較多的EB 類型（P＜ 0.01），見表3。進一步分析發現，Non-EB 組患者HOXB4 基因的mRNA 中位表達水平為2.28（1.13，5.02），與C 組無差別（P＞ 0.05），而EB 組患者HOXB4 基因的mRNA 表達水平為6.45（1.77，10.89），相較于Non-EB 組患者（P＜ 0.01）和C 組（P= 0.001）均升高，差異有統計學意義。

表3 HOXB4 基因與MDS 分型的關系Tab.3 The relationship between HOXB4 gene and MDS classification 例（%）

2.4 HOXB4 表達水平與MDS 預后危險分層的關系HOXB4 基因高相表達組有19 例（79.2%）評為相對高危組，而低表達組只有13 例（52%）評為相對高危組，兩組差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表4。

表4 HOXB4 基因表達水平與MDS 患者預后的關系Tab.4 The relationship between HOXB4 gene expression level and prognosis of MDS patients例（%）

2.5 HOXB4 基因表達水平與白血病轉化之間的關系通過隨訪發現有10 例已進展至AML 階段，其中8 例（33.30%）來自于HOXB4 基因高表達組，2 例（8%）來自于HOXB4 基因低表達組，HOXB4 基因高表達組患者的白血病轉化率明顯高于低表達組（P＜ 0.05），見表4。

3 討論

MDS 是一組起源于造血干細胞的高度異質性的髓系惡性腫瘤，不同患者之間的臨床表現相差很大，對于IPSS-R 評分為極低危的患者，臨床可僅表現為輕度血細胞減少，中位生存期可長達9 年，而評分為極高危的患者則表現為嚴重的血細胞減少、快速向AML 轉化，中位生存期不到1 年。目前研究［6-7］表明，由于造血干細胞本身遺傳損傷事件的累積及骨髓微環境的免疫失調，高?；颊進DS干細胞往往表現為快速增殖但分化阻滯，導致病情逐漸向急性白血病轉化。這一過程中，調控造血干細胞增殖及分化的轉錄因子也起著重要作用［16］。在本研究中，我們發現與C 組相比，MDS 組的造血調控因子HOXB4 mRNA 表達水平升高，并且HOXB4 基因的高表達與患者白細胞減少、原始細胞增多、不良預后分層及白血病轉化相關。

HOXB4 是第一個被證實在人類和小鼠中具有調控正常造血干細胞的自我更新和定向分化作用的HOX 基因。然而，HOXB4 不單有重要的造血調控作用，在許多惡性腫瘤中被認為是一種癌癥相關基因，如白血病、乳腺癌、卵巢癌等［17-19］。KUSAKABE 等［20］發現在人類急性T 淋巴細胞白血病中，HOXB 基因通過可通過表觀遺傳機制被特異性激活，并使白血病前期細胞和白血病細胞具有生長優勢，從而促進疾病的發生發展。ZHANG等［21］曾報道狗和獼猴在移植過表達HOXB4 的CD34+細胞后發生急性髓性白血病，這些白血病細胞存在過表達HOXB4、癌基因表達失調和髓系分化受阻，HOXB4 敲低后，白血病細胞可恢復分化。這些研究表明HOXB4 過表達具有顯著的白血病發生風險。然而，目前關于HOXB4 在MDS 中的作用罕見文獻報道。本研究發現MDS 患者中的HOXB4 基因表達水平與原始細胞比例及白血病轉化相關。因此，我們推測HOXB4 的高表達可引起惡性原始細胞擴增，從而加速MDS 患者向急性白血病轉化。

HOXB4 的異常表達常常與腫瘤的不良預后相關。有研究［22-24］發現在急性和慢性髓系白血病患者中，HOXB4 的高表達均與高腫瘤負荷、化療耐藥及不良生存期相關。而HOXB4 的敲低可通過PI3K/Akt 信號通路下調P-gp、MRP1 和BCRP 的表達，從而逆轉白血病細胞株的多藥耐藥［25］。在卵巢癌中，HOXB4 可通過激活DHDDS 基因增強腫瘤細胞的增殖和侵襲，從而促進疾病惡性進展［17］，而HOXB4 敲低可通過抑制PI3K/Akt 通路下調ABC轉運蛋白，增強紫杉醇和DDP 的細胞毒性作用從而達到增強藥效的目的［26］。盡管已經有許多研究證實了HOXB4 基因的高表達可促進惡性腫瘤進展，但其確切機制目前尚不清楚，需要更多的研究去進一步闡明。

MDS 是一組異質性很大的疾病，患者的治療策略主要依賴于預后風險分層［27］?，F有的評分系統包括分子國際預后評分系統（IPSS-M）、IRSS-R及WHO 分型預后積分系統（WPSS）等都存在一定的不足，如所需的參數較多、評分過程較為復雜等。因此，發現新型可靠又易于檢測的預后分子標志物對MDS 的診治具有十分重要的臨床意義。本研究發現骨髓單個核細胞中HOXB4 基因的高表達與MDS 的疾病進展密切相關，檢測HOXB4 的表達水平，有利于臨床及早發現白血病轉化的高危人群，盡早啟動去甲基化治療、聯合化療及骨髓移植等積極治療手段，改善患者的生存。此外，實體瘤中有基礎研究表明HOXB4 敲低可以增強化療療效，因此，HOXB4 也有望成為治療MDS 的潛在靶點。