鳶尾素調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號通路對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的調(diào)節(jié)作用

侯秀秀, 劉 博, 邢寶瑞, 馮元超, 張亞弟, 石國君, 韓廣普

(河北省滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科, 河北 滄州 161001)

骨質(zhì)疏松是骨科常見病慢性疾病之一,目前我國骨質(zhì)疏松人數(shù)占全球50%左右,女性骨質(zhì)疏松癥的患病率是男性的數(shù)倍,其中老年女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)占總發(fā)病人群的70%,嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。目前主要采取服用雌激素、生長激素、降鈣素等藥物從預(yù)防骨質(zhì)疏松基礎(chǔ)礦化、抗骨吸收、促骨形成幾方面進(jìn)行治療,但極易產(chǎn)生不良反應(yīng)甚至產(chǎn)生耐藥性,因此需要尋找更加安全高效的治療藥物是目前PMOP的研究重點(diǎn)[2]。目前已知鳶尾素是可以通過運(yùn)動、饑餓、高溫、藥物等介導(dǎo)的肌肉產(chǎn)生與分泌的肌源性因子,具有調(diào)節(jié)能量代謝、糖脂穩(wěn)態(tài)、骨骼健康狀況等作用,常用于治療肥胖、II型糖尿病、脂代謝和心血管疾病、骨代謝疾病等。研究顯示,鳶尾素可以通過促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收增加骨量和骨密度,減輕骨質(zhì)疏松癥狀,保護(hù)骨骼健康[3]。Hippo-YAP信號通路參與調(diào)節(jié)成骨代謝,激活Hippo-YAP信號通路可以促進(jìn)成骨分化,加快骨形成及骨缺損重塑[4]。鳶尾素能否通過調(diào)控Hippo-YAP信號通路影響PMOP尚不清楚,本文主要探索鳶尾素對PMOP骨代謝及Hippo-YAP信號通路的影響,以期為PMOP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要材料:200～220g SPF級雌性SD大鼠購于武漢云克隆動物有限公司(生產(chǎn)許可SCXK(鄂)2023-0021);鳶尾素(CM35)購于美國Novoprotein公司;維替泊芬(HY-Bol46)購于美國Med-ChemExpress公司;HE染色試劑盒(G11120)購于北京索萊寶公司;BALP(ARB12444)ELISA試劑盒購于北京百奧萊博公司;CBF-α1(GT04504B)ELISA試劑盒購于上海晶風(fēng)生物公司;P1NP(NLR023)ELISA試劑盒購于武漢紐斯特生物公司;OC(JH-R30432)ELISA試劑盒購于上海繼和生物公司;TAZ(ab307148)、YAP(ab76252)、p-YAP(ab76252)抗體購于上海Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型:腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口,分別從左、右側(cè)臥位切除兩側(cè)卵巢,逐層縫合[5]。對照組只開腹腔暴露雙側(cè)卵巢,不摘除。術(shù)后8周檢測造模大鼠與對照組大鼠骨密度,若造模大鼠骨密度比對照組顯著下降,則證明PMOP大鼠造模成功。

1.2.2分組及處理:造模成功后,將所有實(shí)驗(yàn)大鼠分為對照組(Control組)、PMOP組、鳶尾素低、中、高劑量組(Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組)[6]、鳶尾素高劑量+YAP抑制劑維替泊芬組(Irisin-H+VTPF組)[7],每組18只,共108只大鼠。Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組:造模成功后,分別腹腔注射25、50、100 μg·kg-1·w·-1鳶尾素;Irisin-H+VTPF組:造模成功后,腹腔注射100 μg·kg-1·w·-1鳶尾素及10 mg·kg-1·d·-1VTPF;Control組與PMOP組腹腔注射與Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組等量的生理鹽水;連續(xù)給藥4周。

1.2.3骨密度測定:給藥結(jié)束后,各組隨機(jī)選擇6只大鼠剝離右側(cè)股骨,并使用骨密度儀進(jìn)行掃描,記錄各組大鼠的BMD值。

1.2.4Micro-CT分析:將1.2.3各組大鼠的右側(cè)股骨遠(yuǎn)端,用4%多聚甲醛固定后,4℃冰箱放置3d,生理鹽水浸泡1d,Micro-CT掃描測量Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp。

1.2.5股骨組織形態(tài)學(xué)觀察:從各組剩余大鼠中隨機(jī)選擇6只,剝離大鼠右側(cè)股骨,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,沿冠狀面切片,隨后進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化,蘇木精、伊紅染色,顯微鏡下觀察股骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平檢測:剩余6只大鼠,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,尾靜脈收集血樣,室溫靜置30min,3000rpm離心15min,取上清,ELISA試劑盒檢測BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平。

1.2.7TAZ、YAP、p-YAP蛋白檢測:采血后斷頸處死各組剩余的6只大鼠,迅速取出大鼠右側(cè)股骨,沖洗干凈,加入RIPA裂解液充分裂解,再將裂解液離心后取上清液,測定各組蛋白濃度。蛋白變性,根據(jù)蛋白量大小進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,然后將膜與抗體TAZ、YAP、p-YAP、GAPDH 4℃孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育,ECL暗室曝光,凝膠成像儀采集圖像并分析蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1鳶尾素對各組大鼠骨密度的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠BMD顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠BMD依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠BMD顯著降低(P<0.05);見表1。

表1 各組大鼠BMD比較

2.2鳶尾素對各組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N顯著降低,Tb.Sp顯著升高(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N依次顯著升高,Tb.Sp依次顯著降低(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N顯著降低,Tb.Sp顯著升高(P<0.05);見圖1、表2。

圖1 各組大鼠Micro-CT圖

表2 各組大鼠Tb.Th Tb.Ar Tb.N Tb.Sp比較

2.3鳶尾素對各組大鼠股骨組織形態(tài)學(xué)變化的影響:Control組大鼠股骨組織的骨小梁結(jié)構(gòu)完整且排列有序;與Control組比較,PMOP組大鼠股骨組織的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,骨小梁厚度變薄,空骨陷窩明顯,甚至發(fā)生輕微骨折;與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)逐漸排列有序,空骨陷窩減少,股骨組織損傷逐漸減輕;與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠股骨組織的骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,空骨陷窩明顯增加,股骨組織損傷加重;見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠股骨組織形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.4鳶尾素對各組大鼠骨代謝的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠血清BALP、P1NP、OC、CBF-α1顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1顯著降低(P<0.05);見表3。

表3 各組大鼠血清BALP PⅠNP OC CBF-α1水平比較

2.5鳶尾素對Hippo-YAP信號通路的影響:與Control組比較,PMOP組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與PMOP組比較,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達(dá)依次顯著升高(P<0.05);與Irisin-H組比較,Irisin-H+VTPF組大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠TAZ YAP p-YAP蛋白表達(dá)比較

3 討 論

PMOP是一種卵巢激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥,也是最常見的與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失原因,常發(fā)生于女性絕經(jīng)后的5～10年,其發(fā)病主要是由于女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期,卵巢功能下降,雌激素分泌急劇下降,致使破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收速度加快,骨吸收與骨形成平衡被打破,加快骨轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致骨量減少、骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)遭到破壞,進(jìn)而促使骨脆性和骨折危險(xiǎn)性大幅度提升,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康[8]。又由于之前服用的激素類藥物副作用大且極易產(chǎn)生耐藥性,所以尋求新的治療藥物至關(guān)重要。

鳶尾素作為骨骼肌分泌的肌因子,廣泛分布于人體各組織,參與調(diào)控骨骼相關(guān)基因的表達(dá),可以促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖,進(jìn)而增大骨密度、韌性及強(qiáng)度。研究顯示,鳶尾素可以直接靶向成骨細(xì)胞,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,還可以作用于破骨細(xì)胞祖細(xì)胞,增加骨分化,促進(jìn)骨吸收,進(jìn)而刺激骨重塑[9]。鳶尾素可以上調(diào)BMD、Tb.Th,抑制破骨細(xì)胞生成,促進(jìn)成骨細(xì)胞增加,參與調(diào)控骨代謝以防治骨質(zhì)疏松[10]。本文研究顯示,鳶尾素可以改善PMOP大鼠股骨組織損傷,上調(diào)BMD、Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N,下調(diào)Tb.Sp,說明鳶尾素可以通過促進(jìn)骨形成,防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。

骨是人體重要的生物力學(xué)和生理學(xué)組織,由成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收共同作用的骨代謝是骨骼系統(tǒng)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。BALP是一種下丘腦分泌活性因子,介導(dǎo)破骨細(xì)胞,影響骨吸收,還誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的形成,增加骨密度,提高骨強(qiáng)度。P1NP是骨形成初期的敏感指標(biāo)之一。OC是由成骨細(xì)胞分泌,其表達(dá)高低可以反映成骨細(xì)胞的活性和功能變化。CBF-α1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及成骨細(xì)胞的活性。研究顯示,升高BALP、PⅠNP、OC、CBF-α1水平,有利于骨代謝過程中的骨形成,改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨髓微環(huán)境[11]。本文研究顯示,PMOP大鼠體內(nèi)的BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平下調(diào),而鳶尾素可以上調(diào)BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平,說明鳶尾素可以通過調(diào)控骨代謝參與骨形成與骨吸收過程。

Hippo-YAP信號通路參與器官生成、組織穩(wěn)態(tài)、修復(fù)和再生、細(xì)胞代謝、腫瘤發(fā)生等多種過程,還可參與骨代謝,進(jìn)而影響骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡和存活[12]。TAZ和YAP是Hippo信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)物,當(dāng)Hippo信號通路被激活,導(dǎo)致TAZ和YAP磷酸化,而磷酸化的TAZ和YAP隨后可被隔離在細(xì)胞質(zhì)中降解[13]。研究顯示,激活Hippo-YAP信號通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化,有助于防治骨質(zhì)疏松[14]。本文研究顯示,鳶尾素可以上調(diào)TAZ、YAP、p-YAP蛋白表達(dá),而YAP抑制劑VTPF可以部分逆轉(zhuǎn)鳶尾素對成骨細(xì)胞的增殖和分化的促進(jìn)作用,說明鳶尾素可以通過激活Hippo-YAP信號通路,改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀。

綜上所述,鳶尾素可以通過激活Hippo-YAP信號通路,參與調(diào)控絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨代謝。本研究仍存在局限性,鳶尾素可能通過調(diào)控其他信號通路影響骨代謝,且鳶尾素對Hippo-YAP信號通路的作用機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。