低溫處理對段殖黃線藻生長、油脂積累、光合及抗氧化酶活性的影響

鄧 仟 朱瑞鴻 高保燕 于博涵 唐子涵 張成武

(暨南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)系, 廣州 510632)

微藻憑借種類豐富、生長快速、可以積累多種活性物質(zhì)及具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力, 在生物燃料、營養(yǎng)膳食、日用化妝和廢水處理等方面的潛力不斷被挖掘[1—4], 大部分微藻, 比如普通小球藻(Chlorella vulgaris)、富油新綠藻(Neochloris oleoabundans)、雨 生 紅 球 藻(Haematococcus pluvislis)、微擬球藻(Nannochloropsissp.)[5—8]等都被證實是植物蛋白、色素、脂質(zhì)、脂肪酸及碳水化合物的自然生物來源。段殖黃線藻(Xanthonema hormidioides)是黃藻綱中一類多細(xì)胞的絲狀微藻, 在一定條件下可積累大量油脂以及單不飽和脂肪酸(棕櫚油酸)、多不飽和脂肪酸(二十碳五烯酸)、類胡蘿卜素和金藻昆布多糖, 且因為易于采收和大規(guī)模培養(yǎng)逐漸受到關(guān)注[9,10]。近年來, 絲狀微藻工業(yè)化研究和應(yīng)用愈發(fā)成熟, 比如螺旋藻在營養(yǎng)保健、食品及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中備受青睞[11]; 小黃絲藻(Tribonema minus)具有較高的棕櫚油酸含量(20.72% DW)和生產(chǎn)效率(90.88 mg/L/d), 經(jīng)濃縮分離后棕櫚油酸含量可達(dá)到80.11%[12]; Wang等[13]對6種黃絲藻進(jìn)行研究, 其中同形黃絲藻(Tribonema aequale)金藻昆布多糖含量最高可達(dá)干重的17.20%, 從中分離的金藻昆布多糖能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子和NO的釋放, 并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用; 另外, 在飼料中添加5%的黃絲藻(Tribonemasp.)作為膳食補(bǔ)充劑可以提高金鯧(Trachinotus ovatus)的生長性能和抗氧化能力, 通過上調(diào)非特異性免疫相關(guān)基因和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)還能增強(qiáng)其免疫力, 促進(jìn)肝臟健康[14]。

溫度作為重要的環(huán)境因子對微藻的生長和發(fā)育起著關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明, 低溫有利于增加脂肪酸的多不飽和度、促進(jìn)胞內(nèi)油脂、色素及冷適應(yīng)酶和特殊蛋白質(zhì)的合成。Wei等[15]通過降低培養(yǎng)溫度, 使亞心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)和眼點擬納綠球藻(Nannochloropsis oculata)多不飽和脂肪酸(PUFAs)的比例顯著升高(P＜0.05)。生長在寒冷環(huán)境下的綠藻可以產(chǎn)生高水平的蝦青素、花青素、玉米黃素和總胡蘿卜素等光保護(hù)色素來應(yīng)對低溫引起的ROS過度積累[16]。許多應(yīng)用于商業(yè)和工業(yè)上重要的酶, 包括淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶, 以及近年來在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域需求激增的抗凍蛋白都來源于冷適應(yīng)微生物或藻類[17,18]。文獻(xiàn)報道黃線藻屬(Xanthonema)是典型的嗜冷或適冷型微藻, 廣泛分布于南極地區(qū)或高山土壤[19], 本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)段殖黃線藻是一種典型的適冷型微藻, 為了更好地適應(yīng)低溫, 會通過上調(diào)核糖體、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)和冷休克蛋白(CSPs)等相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞的正常生長和代謝[10]。這也證實了在面對低溫脅迫時, 微藻不僅要平衡光合作用過程中的能量流, 還需要完整的抗氧化系統(tǒng)和保護(hù)機(jī)制來抵抗低溫所帶來的氧化損傷[20]。

除了溫度, 營養(yǎng)元素的種類和含量對微藻的生物質(zhì)生產(chǎn)和生物活性代謝產(chǎn)物的積累也存在密切關(guān)系, 微藻可以利用的無機(jī)營養(yǎng)元素近30多種[21],其中氮在眾多營養(yǎng)因子中的作用最為顯著, 氮脅迫也逐漸成為調(diào)節(jié)微藻生化組成最突出的技術(shù)。在一些產(chǎn)油微藻普通小球藻、柵藻(Scenedesmussp.)、微擬球藻、梭形筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)等生產(chǎn)生物柴油[22,23]及通過氮脅迫增加微藻細(xì)胞內(nèi)重要脂肪酸等方面的研究逐漸受到關(guān)注[24,25]。但由于微藻在培養(yǎng)過程中對環(huán)境的要求、污染物的控制、生物質(zhì)的采收及胞內(nèi)重要化合物的提取等相關(guān)生產(chǎn)難度和成本, 不斷阻礙了微藻的商業(yè)化進(jìn)程, 期望通過篩選最佳的培養(yǎng)藻株和最大限度地提高生產(chǎn)率能夠突破生產(chǎn)瓶頸。因此, 本研究選擇了具備多種優(yōu)勢和競爭力的段殖黃線藻作為實驗材料, 探究溫度和氮濃度兩種關(guān)鍵因子的聯(lián)合作用, 通過對比低溫預(yù)處理和常溫條件下培養(yǎng)的初始藻種在不同培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞的生長狀況、油脂、蛋白質(zhì)、總碳水化合物積累及脂肪酸組成等生化指標(biāo),了解兩種溫度處理下的初始藻種和兩種氮濃度條件下段殖黃線藻的光合活性和抗氧化酶系統(tǒng)對低溫的響應(yīng), 同時為藻類更好的適應(yīng)低溫提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以段殖黃線藻為實驗材料, 該藻株來自Culture Collection of Algae at Gottingen University (SAG),現(xiàn)保藏于暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系微藻生物資源與生物技術(shù)實驗室。

1.2 實驗方法

實驗設(shè)計 將擴(kuò)培后的部分常溫藻種放入5℃水槽中進(jìn)行低溫預(yù)處理, 適應(yīng)1個月后與常溫條件下培養(yǎng)的藻種同時進(jìn)行對比實驗。取處于對數(shù)生長期的低溫預(yù)處理藻種和常溫下培養(yǎng)的藻種沉降后分別接種于Φ6 cm×65 cm的柱狀光生物反應(yīng)器中, 初始接種濃度為(0.3±0.1) g/L, 采用以尿素作為氮源的改良Endo培養(yǎng)基[26], 初始氮濃度為3與18 mmol/L(后文單位簡寫為mmol/L), 單組設(shè)置2個平行。通入含有1%CO2(體積比)的壓縮空氣, 光強(qiáng)設(shè)置為300 μmol/(m2·s), 保持24h的熒光燈持續(xù)光照。分別設(shè)置5個溫度梯度, 即5℃、10℃、15℃、20℃和25℃, 培養(yǎng)周期為24d。

藻細(xì)胞形態(tài)觀察分別取對數(shù)生長期低溫預(yù)處理和常溫條件下培養(yǎng)的藻種以及培養(yǎng)24d時兩種不同氮濃度的藻液, 在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄藻細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化。

生物量測定使用差量法對生物量進(jìn)行測定。將孔徑為0.45 μm的濾膜預(yù)先置于105℃烘箱烘至恒重, 記為W0(g)。每隔24h收取10 mL藻液, 使用循環(huán)水式真空泵進(jìn)行真空抽濾, 將帶有藻細(xì)胞的濾膜再放置烘箱烘至恒重, 記為W1(g)。生物量DW(g/L)＝(W1-W0)×100。

藻粉制備在培養(yǎng)過程中, 每隔3天收集一定量的藻泥進(jìn)行沉降, 去除上清后將藻泥轉(zhuǎn)移至塑料小瓶中, 放置在-20℃冰箱中保存, 之后使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干后避光保存于4℃冰箱中。

總脂含量的測定采用Khozin-Goldberg等[27]方法加以改良, 取80—100 mg凍干藻粉(m0)置于10 mL玻璃離心管中, 放入磁力轉(zhuǎn)子, 加入2 mL二甲基亞砜-甲醇混合溶液(v∶v=1∶9), 于50℃恒溫磁力攪拌器中水浴3h后, 在3000 r/min下離心5min, 上清轉(zhuǎn)移至干凈干燥的玻璃小瓶中。再向離心管中加入4 mL乙醚-正己烷(v∶v=1∶1)混合溶液, 冰浴2h, 再次離心并將上清液至相同玻璃小瓶, 重復(fù)上述步驟直至玻璃離心管內(nèi)藻渣變?yōu)榛野咨Ｏ蛏鲜鲭x心收集的上清液中加入4 mL超純水, 震蕩后靜置分層過夜。將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一小玻璃瓶中, 用氮氣吹干濃縮, 再用乙醚溶解后轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的2 mL塑料離心管中, 記m1。吹干至恒重, 記m2。計算干藻粉中總脂的含量。

脂肪酸含量測定采用Cohen等[28]方法加以改進(jìn)。稱取25 mg凍干藻粉, 置于15 mL螺口玻璃離心管中, 放入磁力轉(zhuǎn)子, 加入2 mL含有的2%硫酸的無水甲醇-甲苯(體積比為1∶1)混合液, 再加入100 μL 0.25%的十九烷酸作為內(nèi)標(biāo), 充入惰性氣體氬氣后密封。放置80℃水浴鍋中恒溫攪拌1.5h進(jìn)行脂肪酸甲酯化, 冷卻至常溫后加入1 mL正己烷和去離子水, 混勻后在3500 r/min下離心5min。取200 μL上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至氣相色譜樣品瓶, 利用高效氣相色譜分析儀測定藻細(xì)胞中脂肪酸組成和含量。

葉綠素及相關(guān)熒光參數(shù)測定參考Beecraft等[29]方 法, 取1 mL樣 品 置 于 樣 品 杯 中, 暗 適 應(yīng)15min后, 使用脈沖振幅調(diào)制葉綠素浮游植物熒光儀(Phyto-PAM), 于32 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下測得葉綠素a含量(Chl.a) ; 并于2 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下測定最大熒光產(chǎn)量(Fm)和最小熒光產(chǎn)量(Fo)[30]。測定快速光響應(yīng)曲線(RLCs), 將測定的光照強(qiáng)度設(shè)置16個點,每個點光照時間為20s。結(jié)束后得到光能利用效率的初始斜率(α)、最大光合成速率, 即最大電子傳輸速率(rETRmax)和半飽和光強(qiáng)(Ik), 采用最小二乘法擬合快速光響應(yīng)曲線, 擬合的模型為 Platt模型[119]。

式中, 光合速率即相對電子傳遞速率(rETR);Ps為光抑制時最大潛在相對電子傳遞速率, 即 rETRmax;PAR為光照強(qiáng)度;α為P-I曲線的初始斜率(Alpha);β為光抑制參數(shù)。

抗氧化酶活性及丙二醛含量的測定分別采用超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3 WST-1法)、過氧化氫酶(CAT)測試盒(A007-1 可見光法)及丙二醛(MDA)測試盒(A003-1 TBA法)對SOD、CAT活性及 MDA含量進(jìn)行測定。

數(shù)據(jù)分析使用Excel 2022、Origin 2023及SPSS 25對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖及差異顯著性分析,以P＜0.05代表差異顯著,P＜0.05代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 段殖黃線藻細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取5℃低溫預(yù)處理和常溫下對數(shù)生長期生長的段殖黃線藻在不同氮濃度下培養(yǎng)第24天的藻液, 在光學(xué)顯微鏡下觀察, 如圖1所示, 段殖黃線藻大多為單列不分支的絲狀體, 藻絲體通常是直的, 但也可以稍微彎曲或在中間形成凸起, 顏色主要表現(xiàn)為淺至亮綠色。與常溫下培養(yǎng)的藻細(xì)胞(圖1A)相比, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻(圖1B)藻絲比較脆弱、長度更短, 容易斷裂成碎片, 甚至可能變成單個細(xì)胞, 但藻體顏色更亮, 細(xì)胞更加“肥大”。此外,在20℃、光照強(qiáng)度為300 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)24d, 初始氮濃度為3 mmol/L的藻細(xì)胞(圖1D)相對18 mmol/L氮濃度的藻細(xì)胞(圖1C)體積更大, 藻細(xì)胞內(nèi)能明顯看到許多油滴。

圖1 段殖黃線藻顯微鏡照片F(xiàn)ig. 1 Microscopic photo of Xanthonema hormidioides

2.2 不同溫度、氮濃度及藻種培養(yǎng)方式對段殖黃線藻生長的影響

經(jīng)低溫(5℃)預(yù)處理和常溫(25℃)條件下培養(yǎng)的段殖黃線藻初始藻種在不同溫度下的生長狀況存在明顯差異(圖2)。在5℃、10℃和15℃條件下,18 mmol/L初始氮濃度的低溫預(yù)處理段殖黃線藻生物量均高于常溫實驗組, 其中15℃時, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻生物量最高可達(dá)10.1 g/L, 常溫段殖黃線藻則為8.74 g/L。尤其在5℃, 兩種氮濃度下的常溫段殖黃線藻基本不生長, 低溫預(yù)處理的段殖黃線藻可以達(dá)到2.2 g/L, 表明常溫段殖黃線藻還未能適應(yīng)驟然的低溫脅迫, 且對氮的利用程度較低。而在20℃和25℃條件下, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻與常溫實驗組生長曲線大體一致, 即使在較高的溫度下低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻依然能夠維持自身的生物量積累。對比兩種不同的初始氮濃度, 隨著溫度升高, 兩種段殖黃線藻的生物量積累均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中低溫預(yù)處理段殖黃線藻在高氮濃度下可達(dá)到最大生物量積累, 最高生物量依次為15℃＞20℃＞10℃＞25℃＞5℃, 分別為10.1、8.7、8.0、5.9和2.2 g/L, 而常溫段殖黃線藻達(dá)到最大生物量依次是20℃＞15℃＞10℃＞25℃＞5℃, 分別為9.4、8.7、7.2、6.2和0.7 g/L。

圖2 不同溫度和初始氮濃度對低溫和常溫處理段殖黃線藻生長的影響Fig. 2 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on the growth of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.3 不同溫度、氮濃度及藻種培養(yǎng)方式對段殖黃線藻油脂積累的影響

段殖黃線藻細(xì)胞油脂積累對氮脅迫的響應(yīng)較為明顯, 初始氮濃度為3 mmol/L的油脂積累量在各溫度下均高于18 mmol/L實驗組(圖3), 且在25℃培養(yǎng)第12天時, 初始氮濃度為3 mmol/L的常溫段殖黃線藻高出18 mmol/L的油脂含量近40%。在同一溫度下, 隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量會隨之增加, 培養(yǎng)后期均能維持較高的油脂含量(5℃除外)。在5—25℃內(nèi), 油脂積累情況總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 各溫度最佳油脂積累情況為20℃＞15℃＞25℃＞10℃＞5℃, 分別占干重的64.20%、57.11%、52.03%、48.40%和39.45%。培養(yǎng)溫度為5℃時, 常溫預(yù)處理段殖黃線藻胞內(nèi)油脂積累顯著降低。但是在較高溫度下, 低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻的油脂積累反而要高于常溫實驗組。由此可知, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻在油脂生產(chǎn)方面的能力得到了有效的提升。

圖3 不同溫度和初始氮濃度對低溫和常溫處理段殖黃線藻油脂積累的影響Fig. 3 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on lipid accumulation in Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.4 不同溫度、氮濃度及藻種培養(yǎng)方式對段殖黃線藻蛋白和碳水化合物的影響

培養(yǎng)基中氮含量是影響藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)積累的關(guān)鍵因素。由圖4可知, 初始氮濃度越高, 段殖黃線藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量越高, 但隨著培養(yǎng)時間的延長,胞內(nèi)總蛋白含量逐漸減少。段殖黃線藻蛋白質(zhì)積累的最佳溫度為15℃, 在培養(yǎng)初期總蛋白質(zhì)含量能達(dá)到細(xì)胞干重的35%以上, 第12天最高可達(dá)43.5%(18 mmol/L)。此外由圖5可知, 溫度變化對段殖黃線藻細(xì)胞內(nèi)總碳水化合物含量的影響較小, 總體占細(xì)胞干重的10%—25%。而在15℃和20℃時, 培養(yǎng)后期的總碳水化合物含量會有所降低, 低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻表現(xiàn)更為明顯。

圖4 不同溫度和初始氮濃度對低溫和常溫處理段殖黃線藻蛋白質(zhì)含量的影響Fig. 4 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on protein content of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

圖5 不同溫度和初始氮濃度對低溫和常溫處理段殖黃線藻總碳水化合物含量的影響Fig. 5 Effects of different temperatures and initial nitrogen concentrations on total carbohydrate content of Xanthonema hormidioides under low and normal temperature treatments

2.5 不同溫度、氮濃度及藻種培養(yǎng)方式對段殖黃線藻的脂肪酸組成和含量的影響

段殖黃線藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸主要由單不飽和脂肪酸, 如棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1); 飽和脂肪酸包 括 肉 豆 蔻 酸(C14∶0)、棕 櫚 酸(C16∶0)、硬 脂 酸(C18∶0); 以及少量的多不飽和脂肪酸, 如二十碳五烯酸(C20∶5)、亞油酸(C18∶2)組成。由圖6A可知, 段殖黃線藻中棕櫚油酸占絕大部分, 最高可達(dá)細(xì)胞干重的27.8% (20℃、3 mmol/L), 其次是棕櫚酸。二十碳五烯酸(EPA)大約占干重的2.0%左右。低溫預(yù)處理和常溫段殖黃線藻最佳脂肪酸積累溫度均為20℃, 分別占干重的49.05%和42.09%。當(dāng)溫度上升至25℃時, 藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量呈現(xiàn)下降的趨勢,這與段殖黃線藻油脂積累規(guī)律基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻在積累棕櫚油酸、油酸、肉豆蔻酸及棕櫚酸方面具有明顯優(yōu)勢。對飽和、單不飽和及多不飽和脂肪酸相對含量進(jìn)行分析(圖6B), 段殖黃線藻中單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的絕大部分, 約50%—60%, 飽和脂肪酸則接近30%左右, 而18 mmol/L初始氮濃度的段殖黃線藻相比于3 mmol/L更加有利于段殖黃線藻多不飽和脂肪酸的積累。圖6C不同類別脂肪酸絕對含量百分比顯示, 在5℃、10℃、20℃和25℃條件下, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻中的單不飽和脂肪酸以及多不飽和脂肪酸含量均高于常溫段殖黃線藻。因此可以得知, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻對于高價值脂肪酸的生產(chǎn)更具優(yōu)勢。

2.6 低溫脅迫對段殖黃線藻光合活性的影響

葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)是一種研究植物光合生理狀況以及反應(yīng)逆境脅迫對機(jī)體產(chǎn)生影響的快速、靈敏的測定和診斷技術(shù)[31]。圖7中列舉了段殖黃線藻在低溫(5℃)下兩種不同預(yù)處理藻種和不同初始氮濃度下的相關(guān)光合參數(shù)。由圖7A可知, 經(jīng)過低溫預(yù)處理的段殖黃線藻在5℃下葉綠素a的含量隨著培養(yǎng)時間的延長不斷增加, 第15天時在初始氮濃度為3 和18 mmol/L條件下的葉綠素a含量分別為9.98和8.91 mg/g。而常溫段殖黃線藻的葉綠素a含量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢,第9天時最低, 為6.59 mg/g (18 mmol/L), 表明低溫脅迫對常溫段殖黃線藻細(xì)胞葉綠素a的積累產(chǎn)生了明顯的抑制作用。圖7B和7C分別表示兩種段殖黃線藻在光合系統(tǒng)II中最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)和潛在光合活性(Fv/Fo)對低溫的響應(yīng), 其中Fv/Fm在0.65—0.75,Fv/Fo在2—3。在接種初期, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻的Fv/Fm和Fv/Fo均小于常溫段殖黃線藻, 但到了培養(yǎng)后期, 常溫段殖黃線藻的光合電子傳遞速率受到抑制,Fv/Fm和Fv/Fo不斷減小, 最終低于低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻。

圖7 低溫(5℃)對段殖黃線藻光合活性的影響Fig. 7 Effect of low temperature (5℃) on the photosynthetic activity of Xanthonema hormidioides

α為光響應(yīng)曲線的初始斜率, 表示微藻對光能的利用率。由圖7D可見, 在5℃培養(yǎng)前6d, 常溫段殖黃線藻的α值均大于低溫預(yù)處理段殖黃線藻, 第9天后α值呈現(xiàn)下降趨勢, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻的光能利用率逐漸超過常溫實驗組。圖7E中ETRmax代表段殖黃線藻在培養(yǎng)15天內(nèi)的最大電子傳遞速率, 第3天時常溫段殖黃線藻的ETRmax是低溫預(yù)處理黃線藻的2倍(18 mmol/L), 但是培養(yǎng)至12天時, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻最大電子傳遞速率不斷升高,在第15天時相比于常溫段殖黃線藻增長了45.3%(3 mmol/L)和9% (18 mmol/L)。根據(jù)圖7F IK值變化趨勢可知, 低溫預(yù)處理后段殖黃線藻對強(qiáng)光的耐受力隨著培養(yǎng)時間的延長同樣會反超常溫段殖黃線藻。綜上表明, 低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻在5℃的低溫脅迫下光合響應(yīng)機(jī)制要明顯優(yōu)于常溫段殖黃線藻。

2.7 低溫對段殖黃線藻抗氧化酶活性的影響

丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過氧化的重要生物指示物, 通常由過量的活性氧(ROS)所引起[32], 因此可以根據(jù)MDA的含量推測出ROS對細(xì)胞膜的損害程度。本研究分別對比了低溫預(yù)處理后不同初始氮濃度(3和18 mmol/L)及與常溫預(yù)處理(18 mmol/L)段殖黃線藻在5℃下的MDA含量, 并進(jìn)行差異顯著性分析。如圖8A所示, 培養(yǎng)15d內(nèi), 低溫預(yù)處理后初始氮濃度為18 mmol/L的MDA含量均顯著高于3 mmol/L實驗組(P＜0.05), 較高的氮濃度在一定程度上促進(jìn)了MDA的合成。對比兩種不同溫度處理的段殖黃線藻, 低溫預(yù)處理最大值出現(xiàn)在第12天,為0.47 nmol/mg protein, 常溫段殖黃線藻則在第15天達(dá)到最高含量0.49 nmol/mg protein, 培養(yǎng)后期低溫和常溫預(yù)處理段殖黃線藻之間存在極顯著差異(P＜0.05)。

圖8 低溫(5℃)對段殖黃線藻MAD、SOD、CAT活性的影響Fig. 8 Effect of low temperature (5℃) on the activities of MAD, SOD, and CAT in Xanthonema hormidioides

超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶, 具有清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的功能,保護(hù)機(jī)體免受自由基的傷害[33]。由圖8B可知, 不同初始氮濃度和不同溫度處理的段殖黃線藻細(xì)胞內(nèi)SOD活性的變化趨勢基本一致, 總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在培養(yǎng)前期差異不顯著, 但在第12天之后3 mmol/L初始氮濃度的實驗組要顯著高于18 mmol/L (P＜0.05)。對比兩種不同溫度預(yù)處理間SOD活性發(fā)現(xiàn), 低溫預(yù)處理段殖黃線藻要顯著高于常溫處理段殖黃線藻(P＜0.05), 兩者均在第5天時達(dá)到最高值, 分別為65.6和52.0 U/mg protein。綜上表明, 無論是5℃的低溫脅迫或是培養(yǎng)后期的氮脅迫,藻細(xì)胞內(nèi)SOD活性均會顯著提升, 低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻更有利于SOD活性的增強(qiáng), 以此促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多余活性氧的清除。

過氧化氫酶(CAT)也是植物體內(nèi)極為重要的逆境生理酶, 可以通過清除線粒體電子傳遞、β-脂肪酸氧化及光呼吸等過程中產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)來防止植物體受到活性氧自由基的傷害[34]。根據(jù)圖8C兩種不同氮濃度之間的活性分析, 培養(yǎng)前期,較低的初始氮濃度會促進(jìn)CAT活性的增強(qiáng), 第3天可以達(dá)到最高值0.64 U/mg protein, 將近18 mmol/L初始氮濃度的3倍。而隨著培養(yǎng)時間的延長, 3 mmol/L氮濃度組的段殖黃線藻CAT活性不斷降低, 并顯著低于18 mmol/L初始氮濃度組(P＜0.05)。此外, 低溫預(yù)處理實驗組CAT活性明顯高于常溫段殖黃線藻, 第5天活性最大值為0.56 U/mg protein, 是常溫段殖黃線藻的2倍, 培養(yǎng)后期兩者均表現(xiàn)為差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

3.1 溫度對段殖黃線藻生長和胞內(nèi)油脂及脂肪酸積累的影響

溫度是影響微藻生長、光合作用活性、維持所有代謝過程最關(guān)鍵的環(huán)境因素之一。通常, 過高或過低的溫度會大大限制微藻的生長、抑制光系統(tǒng)活性、降低營養(yǎng)元素的利用效率及對酶的活性產(chǎn)生影響[35,36]。本文首先探究了5種培養(yǎng)溫度及兩種溫度預(yù)處理段殖黃線藻生物量積累的影響, 發(fā)現(xiàn)其最適生長溫度為15—20℃, 更低或更高的培養(yǎng)溫度均會抑制段殖黃線藻的生物量積累。對比兩種溫度預(yù)處理下的段殖黃線藻生長狀態(tài), 在10℃和15℃時, 低溫預(yù)處理段殖黃線藻相比常溫組生物量分別提升了10.2%和16.0%, 而在5℃時, 常溫實驗組藻細(xì)胞幾乎不生長, 低溫組則可達(dá)到2.2 g/L。這表明經(jīng)過5℃低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻對溫度的適應(yīng)能力明顯增強(qiáng)。

與生物量積累規(guī)律類似, 段殖黃線藻細(xì)胞內(nèi)油脂和總脂肪酸的積累量隨培養(yǎng)溫度的升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 最佳油脂和脂肪酸積累情況為20℃＞15℃＞25℃＞10℃＞5℃, 尤其在20℃和15℃培養(yǎng)后期, 段殖黃線藻總脂含量均可達(dá)到干重的50%, 甚至是60%以上(3 mmol/L)。研究還表明低溫可以促進(jìn)微藻合成更多的PUFAs, 高溫則使SFAs的比例增加[37], 這在微擬球藻和真眼點藻(Eustigmatossp.)中都得到了證實[38,39]。本研究對段殖黃線藻不同溫度下SFAs、MUFA、PUFAs的相對含量進(jìn)行分析也得到了相同規(guī)律。另外, 在5℃和20℃時, 低溫預(yù)處理組占干重的總脂含量分別超出常溫實驗組19.0%和12.2% (第21天、3 mmol/L); 在15℃時, 單不飽和脂肪酸絕對含量提升幅度達(dá)到16.5% (第24天、3 mmol/L); 10℃時, 多不飽和脂肪酸絕對含量提升幅度達(dá)到24.5%。以上表明, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻在相同條件下更加有利于胞內(nèi)油脂和不飽和脂肪酸的積累。

3.2 初始氮濃度對段殖黃線藻生長和胞內(nèi)主要生化組分積累的影響

在眾多營養(yǎng)因子中, 氮對微藻生物量積累、光合活性及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物的合成具有明顯的調(diào)控作用[22]。在最佳生長溫度15℃時, 18 mmol/L初始氮濃度的段殖黃線藻生物量積累分別超出3 mmol/L 4.91 g/L (低溫預(yù)處理組)和3.64 g/L(常溫處理組), 最高的蛋白質(zhì)和總碳水化合物積累也在高氮情況下獲得, 分別占干重的43.5% (15℃、第12天)和27.1% (25℃、第12天)。相反, 低氮組的油脂積累量則均高于18 mmol/L實驗組, 尤其在培養(yǎng)中期, 氮脅迫下段殖黃線藻的油脂含量提升了2—3倍, 最高可占干重的64.20% (20℃、第24天)。這是因為在氮充足的情況下, 會增加微藻的光合速率、促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成, 使碳固定速率和氮同化速率之間形成代謝平衡, 從而減少代謝中所產(chǎn)生的通量轉(zhuǎn)向儲存脂質(zhì)、三酰甘油(TAG)的生物合成[40,41]。

3.3 低溫脅迫對段殖黃線藻光合活性的影響

產(chǎn)氧光合作用是植物、藻類等光合自養(yǎng)生物有效捕獲光能產(chǎn)生化學(xué)能將二氧化碳固定轉(zhuǎn)化為有機(jī)分子和生物質(zhì)的過程[42]。光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化依賴生物體類囊體膜上的光系統(tǒng)Ⅰ (PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)所驅(qū)動, 它們是由色素和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物。植物的光合效率通常會根據(jù)環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變, 比如低溫、高溫、過度輻照、干旱或有毒物質(zhì)都會導(dǎo)致葉綠素a熒光的減少[43],但是光合生物中的光合電子傳遞鏈具有多種適應(yīng)性和適應(yīng)機(jī)制。比如, Roos等[44]研究就報道了一種南極藍(lán)藻黑紫席藻(Phormidium murryi)在低溫、紫外線或者是高光合輻射水平下, 會顯著增加類胡蘿卜素/葉綠素a的比值來減小PSⅡ的功能大小以適應(yīng)外界低溫。Gao等[14]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析, 段殖黃線藻在低溫下會使光合作用相關(guān)蛋白下調(diào), 以此保護(hù)光合系統(tǒng)免受損傷。本研究將低溫和常溫預(yù)處理的段殖黃線藻藻種置于低溫5℃下培養(yǎng), 前9d內(nèi), 常溫實驗組葉綠素a含量從8.73下降至6.59 mg/g(18 mmol/L),Fv/Fm、Fv/Fo及ETRmax值均有所降低,證實了段殖黃線藻在面對低溫脅迫時通過減少葉綠素含量以降低光合速率的適應(yīng)策略。相反, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻無論是葉綠素a含量,還是Fv/Fm、Fv/Fo、ETRmax和IK值均在培養(yǎng)12d內(nèi)隨著時間的延長總體呈現(xiàn)上升趨勢, 可見低溫脅迫并未影響低溫預(yù)處理后段殖黃線藻正常的光合作用, 反而在一定程度上增強(qiáng)了它的最大電子傳遞速率和對強(qiáng)光的耐受能力。

3.4 低溫脅迫對段殖黃線藻抗氧化酶活性的影響

強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)對微藻清除活性氧的氧化損傷至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞代謝過程遇到病害生物、強(qiáng)光和低溫等各種生物或物理脅迫時, 高水平的活性氧(ROS)便會與細(xì)胞內(nèi)某些生物分子進(jìn)行反應(yīng),改變或使其失去生物化學(xué)活性, 破壞機(jī)體正常生長代謝功能。這一系列生物學(xué)反應(yīng)被稱為“氧化應(yīng)激”[45]。微藻抗氧化防御系統(tǒng)包括一系列酶清除劑,如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX), 以及非酶抗氧化劑, 如色素、多糖、多酚、脯氨酸、類胡蘿卜素和類黃酮等[46,47]。本研究發(fā)現(xiàn), 在5℃培養(yǎng)前期, 段殖黃線藻SOD和CAT的酶活性不斷增強(qiáng), 到第5天時, 18 mmol/L低溫預(yù)處理組SOD活性增幅達(dá)到52.8%; CAT酶活性增長了近一倍, 以此保護(hù)機(jī)體免受低溫誘導(dǎo)的氧化損傷。并且, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻SOD和CAT的活性會顯著(P＜0.05), 甚至是極顯著(P＜0.05)高于常溫實驗組, 表明前者對低溫脅迫的氧化應(yīng)激反應(yīng)更加快速和靈敏。

3.5 段殖黃線藻適應(yīng)低溫的生理學(xué)機(jī)制及展望

對于許多適冷微藻來說, 經(jīng)過長期的適應(yīng)和進(jìn)化已經(jīng)具備了大量應(yīng)對低溫的抗逆性策略, 例如增加膜的流動性[48]、分泌細(xì)胞相容性物質(zhì)維持滲透壓平衡[49]、產(chǎn)生多種冷適應(yīng)蛋白抑制冰晶的生長[50]及在分子水平[51,52]的調(diào)節(jié)都得到了大量的研究。就段殖黃線藻而言, 在5℃下培養(yǎng)時, 胞內(nèi)多不飽和脂肪酸(PUFAs)相對含量達(dá)到了最高水平, 通過增加不飽和度改變細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的脂肪酸組成, 降低凝固溫度, 是維持其細(xì)胞膜流動性最顯著的策略之一。細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、色素等生化組分之間代謝通路的調(diào)節(jié), 進(jìn)一步對段殖黃線藻的光合效率產(chǎn)生影響, 使其迅速調(diào)整至最佳狀態(tài)、維持自身代謝平衡以適應(yīng)外部環(huán)境的變化。此外, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻能夠迅速增加其抗氧化酶活性, 發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng), 大大提高了其在生物量和脂質(zhì)等重要代謝產(chǎn)物積累方面的競爭力,對于解決眾多嗜冷或適冷型微藻在產(chǎn)業(yè)化過程中的生產(chǎn)難題、突破效率難關(guān)提供了新的思路和方法。

4 結(jié)論

本文探究了溫度和氮濃度兩種關(guān)鍵因子對低溫及常溫預(yù)處理段殖黃線藻生長和代謝產(chǎn)物積累的影響。研究結(jié)果表明: 段殖黃線藻是一典型適冷型微藻, 能夠適應(yīng)低溫(5℃)生長, 其最佳生長溫度為15—20℃, 低氮脅迫可以促進(jìn)其大量積累油脂。經(jīng)低溫(5℃)預(yù)處理和常溫培養(yǎng)的藻種進(jìn)行對比, 發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻對溫度的適應(yīng)性及油脂和不飽和脂肪酸的積累能力均優(yōu)于常溫藻種。在5℃下, 常溫處理的段殖黃線藻對光的利用率及最大電子傳遞速率受到明顯抑制, 相反, 低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻光合效率則大幅提升。根據(jù)抗氧化酶活性分析, 低溫預(yù)處理后超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性顯著高于常溫段殖黃線藻(P＜0.05)。綜上表明, 經(jīng)過低溫預(yù)處理后的段殖黃線藻通過快速提升光合活性和抗氧化能力, 能夠更好地適應(yīng)低溫并促進(jìn)其生物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的積累。