非小細胞肺癌組織中miR-203啟動子DNA甲基化狀態與 SRC表達及臨床病理因素的相關研究

左淑潤 杭文璐 薄蕓 孔麗萍 李海泉

肺癌是全球發病率和死亡率最高的腫瘤之一,尤其是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數的80%[1],其預后不良仍然是困擾臨床的難題。miRNA-203是微小RNA中的一種,有研究證實,其在肺癌中為抑癌基因[2],其可特異性識別并結合目標 mRNA 的3′-UTR[3],在轉錄后水平調節 mRNA 的降解或抑制其翻譯,此外,miRNA-203 啟動子區受到DNA甲基化的調控[4],影響其轉錄活性。前期,通過生物信息學軟件預測和文獻調研發現 miRNA-203是SRC蛋白的調控因子,SRC蛋白是一種非受體酪氨酸蛋白激酶,由原癌基因c-SRC編碼[5],在肺癌細胞中過表達,但miR-203的表觀遺傳學改變是否會影響SRC的表達尚未明確。因此,本研究計劃分析新鮮的肺癌組織和相應的癌旁組織的miRNA-203啟動子DNA甲基化水平、miRNA-203和SRC的表達水平及與臨床病理因素之間的相關性。旨在探討miR-203基因啟動子區DNA甲基化在肺癌發生發展中的作用及機制。

資料與方法

一、研究對象

選擇2022年12月至2023年6月在徐州醫科大學第二附屬醫院手術切除的NSCLC標本45例以及其對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣>5cm),同時收集患者的臨床病理資料。所獲得的標本需滿足以下要求:(1)術后至少經兩位病理學專家確認為NSCLC,并按照國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control,UICC)分類標準[6]進行分期。(2)在手術前,患者沒有其他惡性腫瘤病史,并沒有接受任何相關治療,包括手術、放化療或內分泌治療等。(3)患者及其家屬充分理解并簽署了相關知情同意書。(4)患者的個人資料和臨床病理信息需完整。本研究已通過徐州醫科大學第二附屬醫院倫理委員會的審查批準(2021-120203)。

二、實驗方法

1. Real-time PCR檢測miR-203基因表達情況

首先,將組織加入Trizol試劑盒(TIANGEN, Beijing, China)中的裂解液進行研磨,以提取總RNA。提取完成后,使用Nano Drop 2000C紫外分光光度計檢測RNA的質量,選擇A260/280nm比值在1.8至2.0之間的5μg/L的RNA為模板進行逆轉錄。根據www.applied-science.roche.com網站的Primer Finder數據庫設計了miR-203引物序列,并委托上海生物工程公司(Shanghai,China)合成。PCR反應體系總體積為20μL,包含2μL特異性引物、8μL DNA模板和10μL LC480 SYBR Green I Mastermix。PCR反應開始時,在95℃進行5分鐘的預變性,然后經過三步擴增周期(95℃ 5秒,50℃ 15秒,72℃ 5秒),重復循環45次。所有樣本均進行了3次重復實驗,取平均值。使用U6 snRNA作為內部參考基因,對數據進行歸一化處理。采用2-ΔΔCT法來比較miRNA-203的相對表達水平。miRNA-203的引物序列5′-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3′(反向)5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′。qRT-PCR反應特異性由熔解曲線判斷,若呈單峰則特異。

2. miR-203 基因啟動子區及 CpG 島的預測

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)UCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi)等基因組數據庫獲取了miR-203基因序列,并進行了相應的基因啟動子調控區域和CpG島的預測。(圖1)根據結果,設計出合適的甲基化特異性引物和非甲基化引物(表1)。

表1 MSP引物序列

圖1 miRNA-203啟動子區CpG 島預測

3. 甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)分析miR-203啟動子DNA甲基化狀態并經過亞硫酸氫鹽(bisulfite sequencing PCR,BSP)測序驗證

先將癌組織及癌旁正常組織在液氮中充分研磨,然后按照DNA提取試劑盒說明書(TIANGEN,Beijing,China)中的順序提取DNA,再用EZ DNA Methylation -DirectTM Kit(ZYMO RESEARCH,USA) 試劑盒對1.5～2.0 μL DNA樣本進行亞硫酸鹽修飾,在PCR儀上進行,修飾條件:98 ℃ 8 min,64 ℃ 3.5h,4℃儲存20 h。根據試劑盒中的純化試劑說明書,對修飾完成的DNA進行純化操作。完成純化后,將DNA置于-20℃的冰箱中進行保存,以備后續使用。以修飾后的DNA模板配置25μL的MSP反應體系,PCR Mix 12.5μL,引物上、下 游 分 別 為1μL,DNA 模 板 2 μL,ddH2O 8.5 μL。擴增條件:預變性95℃ 5 min;變性95 ℃30s,退火30s,延伸72℃ 30 s共38個循環;72 ℃10 min。取15μL PCR 擴增產物,在120V進行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像儀觀察、分析電泳條帶。同時將組織樣本送至上海生工生物工程有限公司進行BSP測序。

4. 免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)測定組織中SRC蛋白的表達

取手術切除的NSCLC癌組織及其對應的癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣>5厘米)。使用10%中性甲醛進行固定,并進行了常規的脫水、透明處理,將組織樣本進行石蠟包埋。制備連續切片,每片厚度為4μm。接著,將切片放入80℃的烤箱中加熱30分鐘,用二甲苯進行脫蠟處理。隨后進行梯度乙醇脫水。為了進行抗原修復,將切片浸泡在0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中加熱處理,并自然冷卻至室溫。使用10%正常山羊血清進行封閉處理,孵育30分鐘后加入稀釋比例為1 ∶50的兔抗人SRC單克隆抗體,4℃過夜孵育。接下來,加入生物素標記的鼠抗兔IgG二抗,在37℃孵育30分鐘。使用DAB顯色后,進行蘇木素復染。進行梯度乙醇脫水處理,使用二甲苯進行透明化,并最后使用中性樹膠進行封片。使用PBS作為陰性對照,用已知含有SRC蛋白的陽性對照切片作為陽性對照。

由兩位病理科醫師采用雙盲法獨立閱片。IHC評分以染色強度和陽性細胞百分率為依據,強度評分為0(無染色)、1(弱染色)、2(中染色)、3(強染色);其比例評分分別為:0(<5%陽性細胞),1(6%～25%陽性細胞),2(26%～50%陽性細胞),3(51%～75%陽性細胞)和4(>75%陽性細胞)。兩項評分乘積≥1 為 SRC蛋白陽性表達。

三、統計學分析

結 果

一、miR-203在肺癌組織與癌旁組織中的表達差異

根據文獻調研提示miR-203在肺癌細胞中低表達,利用 qRT-PCR 技術進一步對 45例肺癌組織及其配對的癌旁組織中miR-203表達水平進行了檢測。結果顯示(圖2),NSCLC組織中miR-203平均表達水平(0.83±0.12)與癌旁組織(1.05±0.23)相比明顯降低,差異有統計學意義(t=-0.348,P=0.003)。

圖2 miR-203在NSCLC癌組織與癌旁組織中的相對表達量及差異(**P<0.01)

二、miR-203基因啟動子 DNA 甲基化水平在非小細胞肺癌組織與癌旁組織中的差異

MSP結果顯示(圖3),在45份癌組織標本中,有30份發生甲基化,甲基化率為66.67%;在其對應的癌旁組織中有11例發生了甲基化,甲基化率為24.44%,兩者相比較,差異有統計學意義(χ2=16.172,P<0.001)。

圖3 MSP檢測miR-203啟動子DNA甲基化結果

三、癌組織與癌旁組織中miR-203基因啟動子CpG島甲基化程度測序結果

部分癌組織中miR-203基因啟動子測序結果提示其啟動子區的平均甲基化水平為86.6%(65/75),相對應的癌旁組織的miR-203的平均甲基化水平為18.7%(14/75),兩者相比差異具有統計學意義(χ2=69.558,P<0.001)(見圖4)。

圖4 部分癌與癌旁組織miR-203啟動子區域甲基化情況簡化圖

四、SRC 蛋白在非小細胞肺癌組織與癌旁組織中的差異

應用文獻調研并結合MIRDB數據庫(http://www.mirdb.org/)搜索miR-203的靶向基因,對靶基因進行篩選,發現SRC 的 3′-UTR 與 miR-203 的 5′端有相互匹配的連續區域(圖5A)。對癌組織與癌旁組織進行IHC分析(圖5B),發現癌組織SRC的陽性率為68.89%(31/45),與癌旁組織SRC的陽性率為33.33%(15/45)相比差異有統計學意義(χ2=11.383,P=0.001)。

圖5 SRC在癌組織與癌旁組織中的表達差異

五、肺癌組織中 miR-203 DNA甲基化與miR-203、SRC蛋白表達的相關性

使用統計學方法評估NSCLC中miR-203啟動子DNA甲基化、miR-203表達和SRC表達之間的相關性。結果提示,在非小細胞肺癌組織中 miR-203 啟動子區 DNA 甲基化水平與 miR-203 表達水平呈負相關(Spearman相關系數rs=-0.615,P=0.021),而與 SRC的表達則呈顯著正相關(Spearman 相關系數rs=0. 703,P=0.002 );其次,miR-203 表達水平與 SRC 表達呈顯著負相關(Spearman 相關系數rs=-0.579,P=0.001)。

六、miR-203 DNA甲基化與非小細胞肺癌患者臨床病理參數的關系

結合患者的臨床病理資料發現miR-203 啟動子區DNA甲基化陽性率在腫瘤直徑大于等于 3cm 組高于腫瘤小于 3cm 組(χ2=4.602,P=0.032);浸潤性腺癌的甲基化陽性率明顯高于微浸潤腺癌(χ2=10.153,P=0.001);在臨床TNM分期中,分期較高組高于分期較低組(χ2=4.849,P=0.028),差異均有統計學意義;而與年齡、性別、腫瘤位置、病理分型等因素之間的差異沒有統計學意義(見表2)。

表2 肺癌組織中miR-203啟動子DNA甲基化與臨床病理特征的關系[n(%)]

討 論

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度約為 20個核苷酸的內源性非編碼小 RNA,在調節細胞周期、基因表達以及生物個體發育等方面發揮著重要的功能[7]。miR-203位于人類染色體14q32.33的一個區域,已被證明與多種癌癥的發生相關[8],本研究發現在非小細胞肺癌組織中 miR-203表達顯著低于配對癌旁組織,發揮著抑癌基因的作用,差異有統計學意義,這與之前的研究結果是相一致的[9];然而其表達水平的降低是否是表觀遺傳學改變導致的,目前在肺癌組織中未見報道。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,在《早期肺癌診斷中國專家共識(2023年版)》[10]中著重介紹了肺癌甲基化在早期診斷中的應用。目前的研究已經指出[11],聯合檢測肺泡灌洗液中的SHOX2和RASSF1A基因甲基化,相較于細胞學檢查和血清生物標志物如癌胚抗原,對肺癌的整體診斷效果更為顯著。另外一項研究也表明[12],在這兩個基因的甲基化PCR聯合檢測中,任何一個陽性結果都能夠將肺腺癌和鱗癌的檢出率分別提升至66.0%和90.9%。這些相關檢測方法已經成功應用于臨床實踐中。

然而,關于miRNA的甲基化檢測仍處于初期研究階段,分子水平的甲基化檢測為癌癥的診斷和治療提供了新的研究思路。miRNA通過調節與啟動子相關的CpG島的高甲基化或低甲基化,來控制抑癌miRNAs或致癌miRNAs的表達[3]。以miR-203為例,在乳腺癌、前列腺癌、肝癌和血液系統惡性腫瘤中,miR-203作為抑癌基因由于啟動子的高甲基化,其表達通常會被下調[13-16]。Du等人的研究還發現[17],在胃癌細胞中,miR-203和miR-375的CpG島甲基化與miRNAs的表達呈負相關。然而在胃癌組織中,這種關系并不明顯,考慮到細胞的雜合性可能是組織樣本中甲基化表達關系不一致的原因。另外,彭恒等人在肺癌細胞中的研究[18]表明,miRNA-203的低表達與其啟動子的高甲基化有關。但到目前為止,在NSCLC組織中,尚未見有相關報道。因此,本研究檢測了miR-203在45例NSCLC癌與癌旁組織中的差異,結果發現,與癌旁正常組織相比較,肺癌組織中 miR-203基因啟動子區 DNA 甲基化水平顯著增加,而其表達水平顯著下調; 同時,通過相關性分析發現肺癌組織中 miR-203 DNA 甲基化水平與其表達水平呈負相關。

miRNAs的甲基化改變可能導致下游增殖或凋亡相關的癌蛋白異常表達,本研究發現 miR-203 可能是SRC蛋白的重要調控因子,SRC是一種非受體酪氨酸激酶,它通過參與多條信號通路,在腫瘤、炎癥及自身免疫性疾病中發揮作用[19]。通過相關性分析發現NSCLC組織中的miR-203甲基化水平與SRC表達呈顯著正向關聯,這表明miR-203基因啟動子區的甲基化狀態可能與SRC蛋白的表達調控相關,這對于了解miR-203的整個網絡調控系統,并進行有針對性的干預具有重要意義。此外,研究還觀察到miR-203基因啟動子區的甲基化與腫瘤直徑、腺癌的浸潤程度以及TNM分期等臨床病理因素之間存在相關性。這提示甲基化狀態可能參與腫瘤侵襲和轉移過程,并有可能影響預后。

綜上所述,本研究結果表明miR-203基因啟動子區DNA甲基化與肺癌的發生和發展密切相關,可能作為潛在的生物標記物用于肺癌的早期診斷和預后評估。這些結果為進一步深入研究miR-203在肺癌中的功能和調控機制提供了重要依據,并為開發新的肺癌治療策略提供了理論支持。