和厚樸酚對肺癌細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用及對Notch信號通路的影響

尹波 黃海 劉勇 張金紅 李俊 吳灃

肺癌是原發于氣管、支氣管和肺的惡性腫瘤,其發病率和死亡率正迅速上升,且呈世界性趨勢[1-2]。此病發病隱匿,早期并無特異性癥狀,多數患者病情進展至晚期才確診[3]。對于晚期肺癌患者,臨床常用根治術聯合術后化療進行治療,但術后產生腫瘤耐藥嚴重影響化療效果,不利于患者預后[4]。和厚樸酚分離自中藥材厚樸,具有廣泛的抗腫瘤活性,對肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤均有抑制作用[5-6]。還有研究[7]報道,和厚樸酚可增加傳統抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用,如紫杉醇、順鉑、多柔比星等。Notch信號通路不僅在細胞生長、增殖及凋亡中發揮重要的作用,而且持續激活可使得腫瘤細胞獲得耐藥性[8]?；诖?本研究擬探究和厚樸酚對肺癌細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用及對Notch信號通路的影響,以期為提高肺癌治療效果提供理論依據。

資料與方法

一、一般材料

1. 細胞株 紫杉醇耐藥的肺癌細胞株A549/Taxol,上皮細胞樣,貼壁生長,經STR鑒定,購自武漢普諾賽公司。

2. 主要儀器 Synergy HT多功能酶標儀購自美國伯騰公司;FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。

3. 藥品與試劑 和厚樸酚純度≥98%,購自成都徳思特公司;紫杉醇,國藥準字H20057065,購自海南中化聯合制藥公司;1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司;MTT試劑、Annecin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司;c-核蛋白類基因(c-Myc)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、切割后半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、cleaved Caspase-9、E鈣黏附蛋白(E-cadherin)、N鈣黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Notch1、Jagged1和Hes1抗體,購自美國Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1. 細胞分組與處理 (1)以不同濃度和厚樸酚(0、10、20、30、40、50 μmol/L)聯合5 nmol/L紫杉醇[9]處理A549/Taxol細胞,篩選試驗濃度。(2)將A450/Taxol細胞分為對照組(含10%胎牛血清的1640培養基正常培養)、紫杉醇組(5 nmol/L 紫杉醇處理24 h)、和厚樸酚+紫杉醇組(試驗濃度和厚樸酚+5 nmol/L紫杉醇處理24 h)和Notch信號通路激活劑組(Jagged1/FC)(試驗濃度和厚樸酚+5 nmol/L紫杉醇+500 μg/L Jagged1/FC處理24 h)。

2. MTT檢測細胞增殖 取對數生長期A450/Taxol細胞,以1×105個/孔接種于96孔板,按分組給予相應處理24 h,再添加含有10%MTT試劑的培養基,繼續培養4 h,棄去上清液,加入100 μL二甲基亞砜溶液溶解,放入多功能酶標儀,570 nm下測定各孔吸光度值,計算實驗組吸光度/對照組吸光度×100%,表示細胞存活率。

3. 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期A450/Taxol細胞,以2×105個/孔接種于6孔板,按分組給予相應處理24 h,收集各組細胞,用預冷的PBS溶液洗滌3次,分別加入Annecin V-FITC、PI染液,暗室中反應30 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡狀態。

4. 劃痕實驗檢測細胞遷移 取對數生長期A450/Taxol細胞,以2×105個/孔接種于6孔板,待細胞融合至80%左右時,用1 mL槍頭垂直培養孔底部劃線,再按分組給予相應處理24 h,光鏡下觀察并記錄劃痕寬度的變化,反映細胞遷移能力。

5. Western Blotting法檢測細胞中相關蛋白表達 取對數生長期A450/Taxol細胞,以2×105個/孔接種于6孔板,按分組給予相應處理24 h,收集各組細胞,加入RIPA裂解液冰上反應40 min,收集上清液測定蛋白濃度,上樣電泳后再電轉,取出PVDF膜用5%脫脂牛奶液,室溫下封閉2 h,4℃下分別孵育c-Myc、Cyclin D1、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Notch1、Jagged1和Hes1抗體(1 ∶1 000)過夜,在37℃下孵育辣根標記的山羊抗兔/鼠IgG二抗30 min,最后滴加ECL發光劑顯影,計算目的蛋白與內參β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

三、統計學分析

結 果

一、不同濃度和厚樸酚對A450/Taxol細胞增殖的影響

與0 μmol/L和厚樸酚組比較,30 μmol/L和厚樸酚組處理后細胞存活率明顯降低(P<0.05);而5 nmol/L紫杉醇與20、30、40、50 μmol/L和厚樸酚聯用時,細胞存活率較同組和厚樸酚組明顯降低(P<0.05),其中30 μmol/L和厚樸酚抑制效果最佳,選用此濃度進行后續實驗(見圖1)。

圖1 不同濃度和厚樸酚對A450/Taxol細胞增殖的影響

二、和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞增殖的影響

與對照組比較,紫杉醇組細胞存活率降低,c-Myc、Cyclin D1表達下調(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細胞存活率降低,c-Myc、Cyclin D1表達下調(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細胞存活率升高,c-Myc、Cyclin D1表達上調(P<0.05,見圖2)。

圖2 和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞增殖的影響

三、和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞凋亡的影響

與對照組比較,紫杉醇組細胞凋亡率升高,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達上調(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細胞凋亡率升高,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達上調(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細胞凋亡率降低,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達下調(P<0.05,見圖3)。

圖3 和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞凋亡的影響

四、和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞遷移的影響

與對照組比較,紫杉醇組細胞遷移能力降低,E-cadherin表達上調,N-cadherin、Vimentin表達下調(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細胞遷移能力降低,E-cadherin表達上調,N-cadherin、Vimentin表達下調(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組細胞遷移能力升高,E-cadherin表達下調,N-cadherin、Vimentin表達上調(P<0.05,見圖4)。

圖4 和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞遷移的影響

五、和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞Notch信號通路的影響

與對照組比較,紫杉醇組Notch1、Jagged1和Hes1表達下調(P<0.05);與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組Notch1、Jagged1和Hes1表達下調(P<0.05);與和厚樸酚+紫杉醇組比較,Jagged1/FC組Notch1、Jagged1和Hes1表達上調(P<0.05,見圖5)。

圖5 和厚樸酚聯合紫杉醇對A450/Taxol細胞Notch信號通路的影響

討 論

紫杉醇是肺癌化療中的常用藥物,主要通過促進微管蛋白聚合,維持微管蛋白的穩定,抑制細胞有絲分裂,若出現耐藥性提示紫杉醇治療失敗[10]。因此,臨床亟需尋找可逆轉紫杉醇耐藥的方法,以提高療效,改善患者預后。

聯合用藥是惡性腫瘤治療的主要方式,生化調節劑通過作用于特定靶點或代謝環節,增強抗腫瘤藥物療效或降低不良反應,而且可逆轉耐藥性[11]。已有研究[12]報道,和厚樸酚與紫杉醇聯用可發揮協同作用,誘導非小細胞肺癌凋亡。但和厚樸酚對肺癌細胞紫杉醇耐藥是否可發揮逆轉作用尚不清楚。本研究結果顯示,和厚樸酚可促進紫杉醇對耐藥細胞株A450/Taxol細胞增殖、遷移的抑制作用,并誘導其凋亡,提示和厚樸酚對肺癌細胞紫杉醇耐藥具有逆轉作用,紫杉醇方案中加用和厚樸酚有望成為治療肺癌的新方法。

惡性腫瘤細胞具有增殖調控失調、浸潤、轉移等生物學特性[13]。c-Myc是Myc基因家族的重要亞型之一,被激活后可啟動細胞分裂增殖程序,其表達不足的情況下,細胞增殖將受到抑制;Cyclin D1也是促進細胞增殖基因,可調控細胞從G1期向S期過渡[14-15]。細胞凋亡參與惡性腫瘤起始過程,并發揮負調控作用,該過程受多種基因控制,細胞內理化因素導致的DNA損傷等可降低線粒體膜電位,促進細胞色素C轉入胞漿,活化Caspase-9,啟動級聯反應,最終活化Caspase-3,導致凋亡細胞解體[16]。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤細胞遷移的重要機制,具體表現為:(1)E-cadherin等上皮細胞標志物低表達或缺失,細胞骨架系統排列發生變化,細胞間黏附功能降低;(2)N-cadherin、Vimentin等間質細胞標志物高表達,細胞獲得間質細胞特性,易向周圍組織侵襲或轉移[17]。本研究中,與紫杉醇組比較,和厚樸酚+紫杉醇組細胞c-Myc、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin表達下調,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、E-cadherin表達上調,進一步說明和厚樸酚可增強紫杉醇對A549/Taxol細胞增殖、凋亡及遷移的影響。

Notch信號通路與惡性腫瘤的發生發展密切相關,近期研究表明,Notch信號通路還與腫瘤耐藥存在關聯性:Takahashi[18]等研究顯示,Notch信號通路參與非小細胞肺癌奧希替尼耐藥,添加Notch信號通路抑制劑后可在體內外降低耐藥性。陳立松等[8]發現,阻斷Notch信號通路可抑制肺腺癌細胞的侵襲能力,并降低其對順鉑的耐藥作用。Sun等[19]結果顯示,阻斷Notch信號通路可逆轉EMT表型,增強宮頸癌細胞對紫杉醇治療的敏感性。本研究通過Western Blotting法檢測細胞中Notch信號通路蛋白Notch1、Jagged1和Hes1表達,發現單用紫杉醇處理后A549/Taxol細胞中Notch1、Jagged1和Hes1表達降低,與和厚樸酚聯用后Notch1、Jagged1和Hes1表達進一步降低,但添加Notch信號通路激活劑Jagged1/FC后可逆轉和厚樸酚的作用,表明和厚樸酚是通過抑制Notch信號通路的過度活化,逆轉A549/Taxol細胞對紫杉醇的耐藥作用。

綜上所述,和厚樸酚可能抑制紫杉醇耐藥肺癌細胞中Notch信號通路過度活化,增強紫杉醇對A549/Taxol細胞增殖、遷移的抑制作用,以及對凋亡的促進作用。但和厚樸酚對紫杉醇耐藥的逆轉作用是否還存在其他分子途徑以及體內療效如何,還有待深入分析。