基于UPLC-MSE 的白術化學成分分析及產地差異研究

楊 亮，于 洋，康舒宇，閆廣利，孫 暉，王喜軍

黑龍江中醫藥大學，經方與現代中藥融合創新全國重點實驗室，國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心，黑龍江哈爾濱 150040

白 術 為菊 科 植物白 術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，始載于《神農本草經》，列為上品，具有補氣健脾、固表止汗、燥濕利水、安胎之功效，多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等癥[1]。白術中主要含有倍半萜類、三萜類、聚乙炔類、香豆素類、苯丙烷類、黃酮類、苯醌和多糖類等化學成分[2]。現代研究表明，白術具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗抑郁、神經保護、調節免疫、調節胃腸運動和調節子宮平滑肌等多種藥理作用[3-5]。

白術作為常用的大宗藥材，其藥用價值廣泛，素有“北參南術”之稱，在國家中醫藥管理局公布的首批百首經典名方中含有白術的方劑多達13 首[6]。白術主產于我國的浙江、湖南、安徽及河北等地，自古以浙江為道地產區，享有“浙八味”“磐五味”之一的美譽。但近年來浙白術產量已大幅度萎縮，目前以安徽、河北和湖南等產地為主[7]。但“土地所出，真偽陳新，并各有法”，受生長環境，土質以及氣候的影響，不同產地的藥材質量差異往往較大，其藥材的質量直接影響到方劑的質量與療效，因此評價不同產地白術藥材的質量，優選產地是保證白術相關經方制劑質量的重要手段之一[8]。目前的研究多采用UPLC 指紋圖譜[9]、三維[10]及多維熒光技術[11]、元素指紋分析技術[12]、GC-MS 指紋圖譜[13]、近紅外漫反射光譜技術[14]等對白術進行質量評價與產地鑒別研究，但這些分析方法尚不能全面、系統地表征不同產地白術藥材的質量差異。

液質聯用技術是一種集高效分離、高靈敏度與高選擇性檢測于一體的現代分離分析技術，可同時測定數十個甚至上百個成分，廣泛用于中藥材不同產地、不同品種、不同藥用部位中次生代謝物或化合物差異性的鑒別分析[15-16]。本研究運用UPLCMSE技術全面分析白術藥材的化學成分，通過多元統計分析出河北、安徽、浙江產區白術的差異化學成分及其變化規律，為白術的產地鑒別及質量評價提供參考，為篩選符合經方制劑開發要求的優質白術藥材奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters AcquityTMUPLC 液相色譜儀（Waters 公司，美國）；SynaptTMG2-Si 質譜分析系統（Waters公司，美國）；Waters AcquityTMUPLC HSS T3 色譜柱（Waters 公司，美國）；MassLynx V4.2 工作站（Waters 公司，美國）；超聲波清洗器KQ-500DB（昆山市超聲儀器有限公司）；低溫超高速離心機ThermoSorvall ST16R（Thermo 公司，美國）；電子分析天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；Progenesis QI V3.0（Waters 公司，美國）；SIMCA14.1 軟件（Umetrics，瑞典）。

1.2 試藥

對照品腺苷（批號110879-202204）、白術內酯I（批號111975-201501）、白術內酯II（批號111976-201501）、白術內酯III（批號111978-201501）均購于中國食品藥品檢定研究院；所有對照品質量分數均≥98%；質譜純乙腈（Thermo Fisher 公司，美國）；色譜純甲酸（賽默飛世爾科技有限公司）；亮氨酸腦啡肽（Sigma 公司，美國）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

白術藥材樣品采自河北、安徽、浙江3 個產區，均由神威藥業有限公司提供，經黑龍江中醫藥大學藥學院吳修紅教授鑒定為菊科植物白術A.macrocephalaKoidz.的干燥根莖。樣品詳細采集信息見表1。

表1 白術樣品信息Table 1 Sample information of A. macrocephala

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取白術藥材粉末（過四號篩）1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，稱定質量，超聲提取1 h（250 W、40 kHz），取出放冷稱定質量，以75%甲醇補足減失質量，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。另等量吸取各供試品溶液400 μL，混勻，制成質量控制（quality control，QC）樣品，用于監測分析系統和方法的穩定性。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取腺苷、白術內酯I、白術內酯II、白術內酯III 對照品適量，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度分別為20.012、20.008、20.017、20.011 μg/mL 的對照品溶液。

2.3 色譜條件

Waters AcquityTMUPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～7 min，1%～40% A；7～12 min，40%～70% A；12～16 min，70%～100% A；16～18 min，100% A；18～19 min，100%～1% A；19～21 min，1% A；柱溫40 ℃；樣品管理器溫度10 ℃；體積流量0.4 mL/min；進樣量3 μL。

2.4 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式檢測，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量50 L/h，提取錐孔電壓4.0 V，樣品錐孔電壓為35 V，正、負離子模式毛細管電壓分別為2.8、3.0 kV。采用亮氨酸-腦啡肽溶液（Leucine Enkephalin，[M ＋H]+556.277 1、[M-H]-554.261 5）為質量鎖定溶液。采用MSE模式采集數據，掃描時間為0.2 s，掃描范圍為m/z50～1 200，質譜數據采集的碰撞能為10～35 V。

2.5 數據采集與分析

數據采集由MassLynx V4.2 工作站完成。應用Progenesis QI 分析軟件對質譜數據進行處理分析，正離子模式下，化合物準分子離子以[M＋H]+、[M＋Na]+、[2M＋H]+的形式被檢測；負離子模式下，準分子離子以[M-H]-、[M＋COO]-、[2M-H]-的形式被檢測。通過分析各成分的保留時間、一級、二級質譜信息結合文獻中報道的化合物裂解規律、同條件下對照品的裂解規律，并與構建的白術化學成分數據庫、MassBank、PubChem 等在線數據庫進行對比分析，完成化合物的識別鑒定。

多元統計分析：通過Progenesis QI 軟件對質譜原始數據進行預處理，將處理后的數據導出到MetaboAnalyst 5.0 網站進行無監督的主成分分析（ principal component analysis ， PCA ）， 再用SIMCA14.1 軟件進行有監督的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），依據OPLS-DA 中的變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）＞3，結合單因素方差分析（P＜0.05）篩選不同產地白術藥材間具有顯著性差異的化學成分。

3 結果與分析

3.1 白術藥材化學成分的鑒定

按“2.3”和“2.4”項下方法進行數據采集，結果發現各產地白術樣品的基峰強度色譜圖（base peak intensity，BPI）大致輪廓較為相似，但色譜峰高度有所差異，提示各產地白術間化學成分的含量存在差異。按“2.5”項下方法分析，最終從白術藥材中鑒定出53 個化學成分，代表性BPI 譜圖見圖1。

圖1 正、負離子模式下白術藥材的基峰強度色譜圖Fig. 1 Basic peak intensity chromatogram of A. macrocephala in positive and negative ion modes

以白術內酯III 為例闡釋化學成分裂解途徑及規律的鑒定過程。首先，Progenesis QI 軟件在9.95 min 時匹配到m/z249.153 4 [M＋H]+的離子峰，其脫水形成m/z231.138 4 的碎片離子，碎片離子m/z231.138 4 丟失-CO、-C3H6、-C5H8形成203.142 4、189.088 4、163.076 8 的碎片離子，碎片離子m/z189.088 4 丟失-CH2形成碎片離子m/z175.075 5；碎片離子163.076 8 丟失-CO2形成m/z119.087 9 的碎片離子，再丟失-CH2形成m/z105.070 0 或丟失-C2H4形成m/z91.056 3，裂解過程與文獻報道一致[17]，二級質譜圖及具體裂解途徑如圖2 所示。通過與白術內酯III 對照品比對，鑒定該化合物為白術內酯III。其他化合物采用相同方法鑒定，具體化合物詳細信息見表2。

圖2 白術內酯III 的二級質譜圖及裂解途徑Fig. 2 MS2 spectrum and fragmentation pathway of atractylenolide III

3.2 不同產地白術差異成分分析

3.2.1 PCA 主成分分析是一種無監督學習方法，它通過提取最重要的分析信息來降低數據集的維度[18]。運用PCA 的方法對不同數據組（包括質控樣本）之間的關系進行評價，所有組的PCA得分圖見圖3。結果顯示，QC 樣品緊密聚集在一起，說明儀器穩定性良好，數據質量良好。3 個產地的白術樣品均分別明顯呈現出組內聚類，組間分離的趨勢，表明不同產地白術樣品化學成分間存在明顯差異。

圖3 正、負離子模式下不同產地白術藥材的PCA 得分圖Fig. 3 PCA scores plots of A. macrocephala from different origins in positive and negative ion modes

3.2.2 OPLS-DA OPLS-DA 可將組間差異最大化，在海量數據集中尋找存在于不同組別間的差異性成分，廣泛用于不同產地藥材之間的差異性研究[19-20]。在PCA 的基礎上，本研究對每個產地與其他2 個產地的樣品分別進行OPLS-DA，結果表明每個產地與其他2 個產地之間均表現出較明顯的分離趨勢，與PCA 結果一致，且組別間分離效果更加顯著，見圖4-A。在OPLS-DA 模型中，各模型組R2X（cum）、R2Y（cum）和Q2值均大于0.5，表明模型構建良好，預測性可靠。對OPLS-DA 進行驗證，設定隨機排列檢驗次數為200 次，見圖4-B。結果顯示，各組模型驗證中原始R2和Q2均大于Y置換后相應的值，且Q2點的回歸線在Y軸的截距小于0，說明模型預測能力好，不存在過擬合現象，可用于區分不同產地白術藥材，模型具體相關參數見表3。散點得分圖（S-plot）可以表示組間的差異成分，數據點離原點越遠，則該變量對樣本分組差異的貢獻越大，利用S-plot 圖可篩選出存在顯著性差異（VIP＞3）的化學成分，見圖4-C。

圖4 正、負離子模式下不同產地白術藥材的OPLS-DA 得分圖、置換檢驗圖及S-plot 圖Fig. 4 OPLS-DA scores plot, permutation test polt and S-plot of A. macrocephala from different origins in positive and negative ion modes

表3 OPLS-DA 模型參數Table 3 Model parameters of OPLS-DA

根據OPLS-DA 結果，以VIP 值＞3，單因素方差分析P＜0.05 為篩選標準，共表征出21 個差異化學成分，具體分為各產地的特有成分3 個及共有成分18 個，包括尿苷、腺苷、L-異亮氨酸、新綠原酸、L-纈氨酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、furan sesquiterpene、9,10-環氧-12（Z）-十八碳烯酸、白術內酯III、白術內酰胺、白術內酯I、白術內酯II、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術酮、雙白術內酯、棕櫚酸等，各成分的量以各樣品相對應的峰面積表示，見圖5。其中河北安國產地具有1 個特有成分，為9,10-環氧-12（Z）-十八碳烯酸，且腺苷、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、furan sesquiterpene、白術內酯I、白術內酯II、雙白術內酯的含量最高。安徽亳州產地具有1 個特有成分，為L-異亮氨酸，且新綠原酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸的含量最高。浙江磐安產地具有1 個特有成分，為白術內酰胺，且尿苷、L-纈氨酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、白術內酯III、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術酮、棕櫚酸含量最高。這些差異成分均可作為區分不同產地白術的特征成分。

圖5 不同產地白術藥材差異化合物對比分析Fig. 5 Analysis of differential compounds in A. macrocephala from different origins

4 討論

目前，《中國藥典》2020 年版對白術的質量控制方法主要為定性鑒別，包括感官評價、顯微鑒定與理化鑒別，無客觀準確的量化指標，具有一定的局限性。目前的研究多以一種或幾種白術內酯類成分的含量作為判斷不同產地白術藥材間質量差異的指標，而中藥為復雜的化學體系，僅靠幾個指標性成分不能全面體現其品質差異[21-[2]]。本研究采用UPLC-MSE技術準確快速地對河北、安徽、浙江產區白術藥材進行分析，鑒定出53 個化學成分并通過多元統計分析方法表征出21 個差異性成分，包括18 個共有差異成分及3 個特有成分。在河北安國產地中腺苷、6,9-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、furan sesquiterpene、白術內酯I、白術內酯II、雙白術內酯的含量最高。安徽亳州產地中新綠原酸、7-羥基香豆素、綠原酸、咖啡酸的含量最高。浙江磐安產地中尿苷、L-纈氨酸、8,9-epoxy atracolactone、4,6-二羥基-3,3a-二氫白術內酯III、白術內酯III、芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術酮、棕櫚酸含量最高。黃小方等[24]采用UPLC-MS 技術對不同產地白術藥材進行分析，發現各產地藥材的差異主要體現在白術內酯類成分上。已有的對白術中化學成分含量檢測的研究顯示，不同產地白術在白術內酯類及有機酸類成分含量上存在一定差別[25-[3]]。本研究采用UPLC-MSE整體化學成分分析所得到的差異化學成分與文獻報道一致性較高。此外，本研究還確定了9,10-環氧-12(Z)-十八碳烯酸為河北安國產地的特有成分，L-異亮氨酸為安徽亳州產地的特有成分，白術內酰胺為浙江磐安產地的特有成分，這些特有成分可作為產地區分的依據。上述分析提示，不同產地白術藥材因所處的氣候、土壤、地勢地貌等環境不同，在化學成分的種類及含量上產生了很大變化，即生成了特有成分與共有成分，提示白術的質量與其產地密切相關。

本研究發現浙江、河北產白術的白術內酯類成分含量明顯高于安徽產地。研究表明，倍半萜類化合物是白術中含量最豐富的生物活性成分之一，其中白術內酯類成分已被證明具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗炎、調節免疫、調節胃腸道功能和神經保護作用[28]；雙白術內酯可通過抑制活性氧生成來減少損傷細胞的死亡，從而發揮抗阿爾茨海默病的作用[29-30]；芹子二烯酮、3β-乙酰氧基蒼術酮具有抗炎作用[31]。而安徽產地的有機酸類化合物如綠原酸、新綠原酸等的含量高于其他兩產地，上述成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、調血脂、降血糖和免疫調節等多方面的藥理作用[32-33]。以上分析提示不同產地白術藥材間的差異化學成分可能對其生物活性產生影響，進而影響其功效及配伍情況下的療效，后續可結合不同層次的藥效學實驗進行闡釋與驗證，為臨床依據不同病癥、不同產地藥材合理的調整用藥提供更好的指導。

本實驗基于河北、安徽、浙江3 個產區的白術藥材展開研究，對不同產地白術藥材的差異性進行分析，找出其特有成分及共有差異成分，為白術的產地鑒別及質量評價提供了重要參考，也為后續含白術的經典名方開發、中藥質量標志物研究及藥材質量標準的制定提供科學依據和理論支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突