基于腸道菌群探究一貫煎多糖的結(jié)構(gòu)及改善小鼠肝纖維化作用

魏 霞 ，王星星，方勤勤，徐 瑩 ，秦路平，劉 平，劉 偉 *，吳建軍*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥學(xué)部，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，上海 201203

3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

肝纖維化是病毒性肝炎、非酒精性肝病、膽汁淤積性肝病等慢性肝病共有的病理變化，主要表現(xiàn)為肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度增生與沉積，從而導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)異常改變，并影響肝臟正常生理功能。由于肝纖維化病理機制復(fù)雜，目前尚無療效明確的化學(xué)藥物或生物學(xué)藥物可供臨床應(yīng)用[1-3]。一貫煎是現(xiàn)代臨床治療慢性肝病“肝腎陰虛”證的代表方劑，由清代名醫(yī)魏之琇所創(chuàng)，由生地黃、北沙參、麥冬、當(dāng)歸、枸杞和川楝子組成。古籍中記載為“統(tǒng)治脅痛、吞酸、疝瘕，一切肝病”。近代名醫(yī)張山雷稱其為“涵養(yǎng)肝陰無上良方”。一貫煎作為治療慢性肝病的代表名方，已有實驗研究揭示了一貫煎治療肝纖維化和肝硬化的部分作用機制，主要與抗氧化應(yīng)激、提高肝細胞生物合成、抑制肝星狀細胞活化、減輕膠原沉積、改善肝竇血管化、促進肝細胞再生等有關(guān)[4-6]。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)包括肝纖維化在內(nèi)的各種肝臟疾病的發(fā)生進展通常伴隨著腸道菌群的失調(diào)，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，可有效緩解肝臟疾病[7-9]。一貫煎是否可通過調(diào)節(jié)腸道菌群進而發(fā)揮改善肝纖維化的作用尚不清楚。現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明一貫煎含有大量的多糖類成分，其含量高達30%[10]。目前，已有針對方中生地黃、北沙參、麥冬、當(dāng)歸和枸杞等單味藥材多糖成分的功效研究[11-17]，但針對全方多糖的研究尚未見報道。因此，本研究采用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，考察一貫煎多糖組分對小鼠肝功能指標、纖維化相關(guān)指標和肝臟病理學(xué)改變等的影響，并基于腸道菌群分析，探討一貫煎多糖發(fā)揮藥效作用的途徑，以期為揭示一貫煎抗肝纖維化物質(zhì)基礎(chǔ)、指導(dǎo)臨床應(yīng)用與研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

6 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠（20～22 g），購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（滬）2017-0005。動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房，溫度為（25±2）℃，相對濕度為（50±5）%，光照明、暗周期各12 h。動物實驗通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（PZSHUTCM201016007）。

1.2 藥材

生地黃（產(chǎn)地河南溫縣，生產(chǎn)批號YL-21-01-01）、枸杞子（產(chǎn)地寧夏中寧，生產(chǎn)批號YL-21-01-07）、麥冬（產(chǎn)地浙江金華，生產(chǎn)批號YL-21-01-09）、當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅岷縣，生產(chǎn)批號YL-21-01-06）、北沙參（產(chǎn)地內(nèi)蒙赤峰，生產(chǎn)批號YL-21-01-08）和川楝子（產(chǎn)地四川涼山，生產(chǎn)批號YL-21-01-10）六味藥材均由安徽致和堂藥業(yè)有限公司提供，均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳建軍副教授鑒定，分別為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根、茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實、百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根、傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels 的干燥根、傘形科植物珊瑚菜GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.的干燥根和楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實。

1.3 藥品與試劑

單糖標準品L-巖藻糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、L-鼠李糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、L-阿拉伯糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-半乳糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-葡萄糖（質(zhì)量分數(shù)99.6%）、D-木糖（質(zhì)量分數(shù)99.9%）、D-甘露糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-果糖（質(zhì)量分數(shù)≥99%）、D-核糖（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-半乳糖醛酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-葡萄糖醛酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；L-古羅糖醛酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%）、D-甘露糖醛酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%）均購自青島博智匯力生物科技有限公司。3500 Da 透析袋購自上海源葉生物公司；DEAE Sephrose Fast Flow 弱陰離子交換樹脂購自瑞典GE Healthcare 公司；CCl4、橄欖油、羧甲基纖維素鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、乙醇、硫酸、苯酚等試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒，羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20200716、A030-1）；PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4 主要儀器

Dionex ICS5000 型離子色譜儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司），1100 型液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司），LC-10N-50A 型冷凍干燥機（LICHEN 公司），UV-3600 型紫外可見近紅外光譜儀（日本SHIMADZU 公司），2000 傅里葉紅外儀（美國PerkinElmer 公司），SU8100 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本HITACHI 公司），MC1000型離子濺射儀（日本HITACHI 公司）。

2 方法

2.1 一貫煎多糖功效組分的制備

一貫煎出自清代錢敏捷的《醫(yī)方絜度》，《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7 首方劑）》明確一貫煎處方劑量為北沙參、麥冬、當(dāng)歸各5.60 g，生地黃、枸杞子各11.19 g，川楝子7.46 g，制法為水煎服。根據(jù)《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》規(guī)定“水煎服”應(yīng)參照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，即待煎藥物應(yīng)當(dāng)先行浸泡，浸泡時間一般不少于30 min，加水量應(yīng)沒過藥材2～5 cm 為宜，滋補藥物先用武火煮沸后，改用文火慢煎約40～60 min，每劑藥一般煎煮2 次。本研究根據(jù)上述規(guī)定進行一貫煎制樣，合并2 次水煎液，減壓濃縮后加95%乙醇至乙醇體積分數(shù)為70%，室溫靜至過夜后，4 000×g離心20 min，棄去上清液，收集沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2 次，待室溫揮干至無醇味，用少量純水溶解，冷凍干燥，得一貫煎粗多糖YGJP。取約5 g 的YGJP 溶解于15 mL 的蒸餾水，8 000×g離心10 min 后吸取上清液進行上樣弱陰離子交換樹脂柱（DEAE Sepharose Fast Flow，500 mm×55 mm），依次用蒸餾水及0.2、0.5 mol/L 的NaCl 溶液洗脫，分別收集洗脫液，使用苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測洗脫峰。按照洗脫峰收集各洗脫部位，減壓濃縮，透析48 h，冷凍干燥，即得到各一貫煎多糖組分YGJP-W、YGJP-0.2 和YGJP-0.5[18-19]。

2.2 一貫煎多糖組分的化學(xué)表征

2.2.1 總糖、糖醛酸及蛋白含量測定 采用苯酚-硫酸法測定一貫煎多糖樣品的總糖含量。精密稱取葡萄糖標準品5.00 mg，用蒸餾水定容于50 mL 量瓶中，得質(zhì)量濃度100.0 μg/mL 的葡萄糖母液。分別精密量取0、0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的葡萄糖母液于20 mL 具塞試管中，各以蒸餾水補至2.0 mL，配成系列質(zhì)量濃度為0、20、40、60、70、80、90、100 μg/mL 的葡萄糖對照品溶液，然后加入1.0 mL 的6%苯酚及5.0 mL 濃硫酸，搖勻，室溫反應(yīng)20 min 以后于490 nm 測定吸光度（A）。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以A值為縱坐標（Y），得標準曲線。取3 份一貫煎多糖樣品各5 mg，用蒸餾水定容于50 mL 量瓶中，按照標準品同法操作，根據(jù)標準曲線計算一貫煎多糖樣品的總糖含量。

采用間羥基聯(lián)苯法測定一貫煎多糖樣品的糖醛酸含量。精密稱取半乳糖醛酸標準品約為10.00 mg，用蒸餾水定容于10 mL 量瓶中，得質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL 的半乳糖醛酸溶液，精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的半乳糖醛酸母液于10 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，配成系列質(zhì)量濃度約為 0、20、40、60、80、100 μg/mL 的半乳糖醛酸對照溶液。依次吸取半乳糖醛酸對照溶液0.5 mL 于20 mL 具塞試管中，冰浴冷卻后加入3.0 mL 四硼酸鈉-硫酸溶液，混勻，在沸騰水浴中加熱5 min；以冰浴冷卻至室溫后，加入50 μL 的0.15%間羥基聯(lián)苯溶液，搖勻后，使用紫外分光光度儀在520 nm 處測定其A值。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以A值為縱坐標（Y），得標準曲線。取3 份一貫煎多糖樣品各5.00 mg，用蒸餾水定容于50 mL 量瓶中，取溶液各0.5 mL（每份相當(dāng)于50 μg 多糖樣品）于20 mL 具塞試管中，按照標準品同法操作，根據(jù)標準曲線計算一貫煎多糖樣品的糖醛酸含量。

使用BCA 蛋白定量分析試劑盒測定，按照試劑盒說明配制工作液，并配制1 mg/mL的樣品溶液。根據(jù)微孔板方案（樣品與工作液的比例為1∶8），取3 份一貫煎多糖樣品按照標準曲線同法操作，根據(jù)標準曲線計算一貫煎多糖樣品的蛋白含量。

2.2.2 紫外光譜掃描分析 將一貫煎多糖樣品用純水溶解后配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，用紫外-可見光分光光度計在200～400 nm 進行掃描。

2.2.3 相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）對一貫煎多糖組分進行相對分子質(zhì)量測定。分別取相對分子質(zhì)量已知的Dextran P-系列標準葡聚糖P-5（6 100）、P-10（9 600）、P-20（21 100）、P-50（47 100）、P-100（10 700）、P-200（19 400）、P-400（33 700）和P-800（64 200）各2 mg，加入1 mL 的流動相，即0.22 μm 水相濾膜濾過后的0.2 mol/L 的NaCl 溶液，以10 000 r/min 離心10 min，取上清液置于液相小瓶，即得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的系列標準品溶液；同法制得2 mg/mL 的一貫煎多糖樣品溶液，進行HPGPC 分析，色譜條件如下：色譜系統(tǒng)為Agilent1100，色譜柱為Shodex SUGAR KS-804（300 mm×8 mm）和KS-802（300 mm×8 mm）串聯(lián)；流動相為0.2 mol/L 的NaCl 溶液，柱溫為40 ℃，體積流量為0.8 mL/min，進樣體積為20 μL，檢測器為示差檢測器。標準曲線的繪制處理及相對分子質(zhì)量計算由GPC 軟件自動完成，根據(jù)測定樣品的保留時間，可從標準曲線中求得一貫煎多糖的相對分子質(zhì)量分布。

2.2.4 FT-IR 分析 取約2 mg 的一貫煎多糖樣品與100 mg 的干燥KBr 混合，研細后壓片，在400～4 000 cm-1進行紅外掃描，對掃描圖的吸收峰進行解析。

2.2.5 單糖組成分析 采用高效離子交換色譜儀（high-performance ion exchange chromatogram，HPIEC）測定單糖組成。精密稱取13 個單糖對照品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、古羅糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸）約3 mg，用去離子水配制成30 μg/mL 的混合對照溶液。精密稱取YGJP-W 樣品約5 mg 置于安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液2 mL，在121 ℃加熱2 h，準確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重復(fù)甲醇清洗2～3 次。加入去離子水渦旋混勻，吸取200 μL 加入800 μL 去離子水，在12 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。色譜系統(tǒng)采用Thermo ICS 5000＋離子色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國），色譜柱為Dionex CarbopacTMPA20（150 mm×3 mm，10 μm），流動相A 為H2O，B 為0.1 mol/L NaOH 水溶液，C 為0.1 mol/L NaOH、0.2 mol/L NaAc，梯度洗脫（0～26.0 min，95% A、5% B；26.0～26.1 min，95%～85% A、5% B、0～5% C；26.1～42.0 min，85% A、5% B、10% C；42.0～42.1 min，85%～60% A、5%～0 B、10%～40% C；42.1～52.0 min，60% A、0～40%B、40%～0 C；52.0～52.1 min，60%～95% A、40%～5% B；52.1～60.0 min，95% A、5% B）；體積流量為0.5 mL/min，進樣量為5 μL；柱溫為30 ℃；檢測器為電化學(xué)檢測器。根據(jù)絕對定量方法，測定不同單糖質(zhì)量，根據(jù)單糖摩爾質(zhì)量計算出各單糖的物質(zhì)的量比[20-21]。

2.2.6 SEM 分析 取約5mg 的干燥后的一貫煎多糖粉末樣品，粘附于含有雙面粘合劑的導(dǎo)電碳膜上，置于離子濺射儀的樣品艙中，進行噴金40 s 左右。接著將樣品取出，置入掃描電鏡觀察室，在2.0 kV加速電壓下使用掃描電子顯微鏡，進行觀察。

2.3 YGJP-W 對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用

2.3.1 動物分組 取35 只雄性C57 小鼠，隨機平均分為5 組，分別為對照組、模型組、陽性藥組和不同劑量YGJP-W 給藥組。

2.3.2 造模與給藥 按2 mL/kg ip 15% CCl4-橄欖油，1 周注射3 次（周一、周三與周五），共造模6周，每周記錄1 次動物體質(zhì)量。自造模第4 周第1天起，YGJP-W 低、高劑量組分別按50、100 mg/kg體質(zhì)量的劑量 ig 0.3% CMC-Na 溶液配制的YGJP-W 溶液，陽性藥組按 10 mg/kg ig 0.3%CMC-Na 溶液配制的索拉菲尼，對照組和模型組ig同體積0.3% CMC-Na 溶液，每日ig 1 次。

2.3.3 動物處理取材方法 各組小鼠在造模的第6周末最后1 次給藥后禁食12 h。各組小鼠稱定質(zhì)量后用3%戊巴比妥鈉，按照0.1 mL/10 g 體質(zhì)量注射進行麻醉。待麻醉成功后，腹主動脈取血，全血放置4 ℃靜置后在4 000 r/min 離心15 min，取上清放置-80 ℃冰箱備用。而后摘取小鼠肝臟和脾臟，用濾紙吸取血液后拍照、稱定質(zhì)量并記錄。收集腸道內(nèi)容物，用于16S RNA 檢測。然后取小鼠肝大葉同一部位切取約1 cm×1 cm 大小肝組織放入10%中性甲醛緩沖液固定，以制作病理切片。

2.3.4 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）檢測 全自動化分析法檢測血清肝功能將血清樣本室溫解凍，振蕩混勻，按標號的順序依次放入曙光醫(yī)院檢驗科全自動化分析儀中，分析儀檢測試劑瓶中加入相應(yīng)的ALT 和AST 試劑，按照試劑盒說明書步驟檢測ALT 和AST 活性。

2.3.5 HE 染色和天狼猩紅染色觀察肝臟組織學(xué)變化 取小鼠肝大葉同一部位肝組織，置于10%中性甲醛緩沖液固定，自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片。HE 和天狼猩紅染色，將封好的片子用數(shù)據(jù)掃描切片機自動掃描，觀察肝細胞損傷、炎癥浸潤、膽管反應(yīng)、膠原纖維增生與沉積程度。并采用圖像分析軟件Leica LAS Image Analysis 對天狼猩紅染色陽性面積進行定量分析。

陽性染色面積百分比＝陽性染色面積/圖片總面積

2.3.6 堿水解法檢測肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量 使用堿水解法對肝組織中的HYP 含量進行檢測，稱取肝組織50 mg，水解，調(diào)pH 6.0～6.8，檢測步驟按照試劑盒說明書操作進行。

2.3.7 小鼠腸道微生物分析 取收集到的對照組、模型組和YGJP-W 高劑量組的小鼠糞便，采用MagPure Soil DNA LQ Kit（Magan）試劑盒提取糞便總DNA，利用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的濃度和純度。采用引物343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）擴增16S rRNA 基因的V3-V4 可變區(qū)。PCR 擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用Illumina NovaSeq 6000 測序平臺進行測序。測序由上海毆易生物技術(shù)有限公司完成。測序數(shù)據(jù)進行預(yù)處理生成優(yōu)質(zhì)序列之后，采用Vsearch 軟件，根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個OTU。序列相似度大于或等于97%被歸為1 個OTU 單元，挑選出各個OTU 的代表序列，使用Silva（version138）數(shù)據(jù)進行比對注釋，進行分析。

2.4 YGJP-W 對菌群耗竭后CCl4 誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用研究

2.4.1 抗生素溶液（ABX）制備：稱取1 g 甲硝唑、1 g 青霉素G 鉀、1 g 硫酸新霉素和0.5 g 鹽酸萬古霉素，倒入1.5 L 干凈的塑料瓶中，加入1 L 的蒸餾水，渦旋混勻，即得抗生素溶液[22]。

2.4.2 動物分組 取42 只雄性C57 小鼠，隨機平均分為6 組，分別為對照組、模型組（CCl4）、YGJP-W組（CCl4＋YGJP-W）、對照加抗生素組（ABX）、模型加抗生素組（CCl4＋ABX）和YGJP-W 加抗生素組（CCl4＋YGJP-W＋ABX）。

2.4.3 造模與給藥 模型組按2 mL/kg ip 15%CCl4-橄欖油，每周注射3 次（周一、周三與周五），共造模6 周，對照組和對照加抗生素組按2 mL/kg ip 空白橄欖油，每周記錄1 次動物體質(zhì)量。自造模第4周第1 天起，YGJP-W 組和YGJP-W 加抗生素組均按100 mg/kg ig 0.3% CMC-Na 溶液配制的YGJP-W溶液，其他組ig 同體積0.3%CMC-Na 溶液，每日ig 1 次。加抗生素組小鼠飲用水換為抗生素溶液，其他組自由飲用正常水。

2.4.4 動物處理取材與指標檢測 本實驗動物處理取材同“2.3.3”項，血清ALT 和AST、肝組織HE 染色、天狼猩紅染色與 HYP 含量檢測同“2.3.4”～“2.3.6”項。

2.4.5 血清總膽紅素、間接膽紅素、直接膽紅素和總膽酸檢測 將血清樣本室溫解凍，振蕩混勻，按標號的順序依次放入曙光醫(yī)院檢驗科全自動化分析儀中；分析儀檢測試劑瓶中加入相應(yīng)的血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）和總膽酸（total bile acid，TBA）試劑，按照試劑盒說明書步驟檢測TBIL、IBIL、DBIL 和TBA 活性。

2.4.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time PCR）稱取肝組織50 mg，加trizol 1 mL 提取總RNA，具體操作步驟按說明書進行，應(yīng)用NanoVue濃度檢測儀，檢測RNA 濃度及RNA 純度（A260/280和A260/230）。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為35 ℃反應(yīng)10 min，55 ℃逆轉(zhuǎn)錄20 min，85 ℃變性5 min，即得cDNA。取384 孔PCR 板加樣，Real-time PCR 法檢測對應(yīng)指標，采用2-ΔΔCt法計算各mRNA 表達量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用非參數(shù)檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，組間多重比較分析采用One-way ANOVA 結(jié)合LSD 多重比較分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一貫煎多糖組分的化學(xué)表征

3.1.1 制備及總糖、糖醛酸和蛋白含量測定 根據(jù)一貫煎組方，取北沙參、麥冬、當(dāng)歸各56.0 g，枸杞子、生地各111.9 g，川楝子（敲碎）74.6 g，通過2 次煎煮后醇沉制備得到一貫煎粗多糖（YGJP）93.2 g，得率為19.98%。取5.20 g 的YGJP 經(jīng)弱陰離子交換樹脂（DEAE Sepharose Fast Flow，500 mm×55 mm）分別以蒸餾水、0.2 和0.5 mol/L 的NaCl溶液洗脫，洗脫曲線見圖1。依次得到3 個部位：YGJP-W（3.02 g）、YGJP-0.2（0.23 g）和YGJP-0.5（0.09 g），得率分別為58.08%、4.42%、1.73%。結(jié)果顯示YGJP-W 是YGJP 的主要部位，從一貫煎整方藥材制備得到Y(jié)GJP-W 的總得率為11.60%。采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，標準曲線的回歸方程為Y＝5.628X＋0.071 6，R2＝0.996 7，計算數(shù)據(jù)顯示YGJP-W 的總糖質(zhì)量分數(shù)為（92.48±2.75）%。采用間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸質(zhì)量分數(shù)，標準曲線的回歸方程為Y＝7.221X＋0.037 3，R2＝0.997 8，計算數(shù)據(jù)顯示YGJP-W 的糖醛酸質(zhì)量分數(shù)為（1.87±0.14）%。采用BCA 蛋白定量分析測定蛋白含量，標準曲線的回歸方程為Y＝0.831X＋0.154，R2＝0.998 4，計算數(shù)據(jù)顯示YGJP-W 的蛋白含量為（4.39±1.65）%。分析結(jié)果說明YGJP-W 主要是中性糖類成分，含有極少量蛋白，幾乎不含糖醛酸類成分。

圖1 YGJP 經(jīng)DEAE 瓊脂糖離子交換色譜柱的洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of YGJP on a DEAE agarose ion exchange chromatographic column

3.1.2 相對分子質(zhì)量分布測定 采用HPGPC 對YGJP-W 的相對分子質(zhì)量分布進行測定。如圖2-A所示，YGJP-W 的HPGPC 譜圖除NaCl 溶劑峰外，分別在14.9、19.7 min 處表現(xiàn)出2 個主要峰，表明YGJP-W 存在非均一性。根據(jù)標準曲線和HPGPC軟件計算，結(jié)果顯示2 個主要峰的平均相對分子質(zhì)量分別為1.74×105和5.6×103，而1.74×105和5.6×103的峰含有1 個明顯的肩峰，是由于存在2種相對分子質(zhì)量接近的多糖導(dǎo)致，HPGPC 結(jié)果說明YGJP-W 至少是由2 種不同相對分子質(zhì)量的多糖組成的精多糖。

圖2 YGJP-W 的基本結(jié)構(gòu)特征Fig. 2 Basic structural characteristics of YGJP-W

3.1.3 紫外光譜掃描分析 如圖2-B 所示，YGJP-W在260 nm 處無明顯的吸收峰，說明其不含核酸類物質(zhì)，在280 nm 處表現(xiàn)微弱的吸收峰，說明其含有極少量的蛋白類物質(zhì)，跟BCA 蛋白定量分析結(jié)果一致。

3.1.4 FT-IR分析 YGJP-W的FT-IR圖譜表現(xiàn)出典型的多糖特征吸收峰（圖2-E）。3 422、2 935、1 420 cm-1的3 個強吸收峰分別來自O(shè)-H、C-H 及環(huán)外C-O 的伸縮振動，1 654 cm-1的強吸收峰來自羥基O-H 的彎曲振動，而1 349 cm-1的吸收峰來自C-O的彎曲振動，1 250～1 000 cm-1的峰來源于糖環(huán)內(nèi)C-O 的伸縮振動，吡喃糖在此范圍內(nèi)表現(xiàn)為3 個吸收峰。YGJP-W 在此范圍內(nèi)表現(xiàn)出3 個吸收峰（1 030、1 154 和1 246 cm-1），表明吡喃糖的存在。927 和818 cm-1的吸收峰表明存在β-D型果糖呋喃糖。YGJP-W圖譜在1 740 cm-1附近沒有峰，說明YGJP-W 不含有-COOH 官能團，即不含有糖醛酸，為中性多糖，跟糖醛酸檢測結(jié)果一致。

3.1.5 單糖組成分析 13 個單糖對照品的離子色譜圖顯示出13 個峰（圖2-C），由于各單糖在離子色譜的響應(yīng)度不同，導(dǎo)致其13 個單糖對照品的峰面積各異，YGJP-W 完全酸水解后的離子色譜圖顯示出4 個峰（圖2-D），通過對照品比較可知為半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖，物質(zhì)的量比為1.0∶2.8∶1.4∶1.6。單糖分析結(jié)果再次證明YGJP-W 不含有糖醛酸類，為中性多糖。

3.1.6 SEM 分析 200 倍電鏡下（圖2-F），YGJP-W呈不規(guī)則的致密結(jié)構(gòu)，表面較為光滑，結(jié)構(gòu)較為完整；在500 倍鏡下，YGJP-W 致密結(jié)構(gòu)被放大，表面凹凸不平，呈褶皺狀；在2 000 倍鏡下，樣品表面可見不規(guī)則凸起結(jié)構(gòu)，可能是由于多糖樣品分子間相互作用較強，導(dǎo)致聚合緊密。

3.2 YGJP-W 對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用

3.2.1 對血清肝功能的影響 血清生化結(jié)果見圖3，與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST 顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，YGJP-W 各給藥組與陽性組血清ALT 和AST 均有不同程度降低，其中YGJP-W 低劑量組和陽性藥物組血清ALT 和AST 下降明顯（P＜0.05），YGJP-W 高劑量組血清ALT（P＜0.01）和AST 同樣下降明顯（P＜0.05）。

圖3 YGJP-W 對CCl4 誘導(dǎo)肝纖維化小鼠血清生化的影響 (±s, n = 7)Fig. 3 Effects of YGJP-W on serum biochemistry in CCl4-induced liver fibrosis mice (±s, n = 7)

3.2.2 對CCl4肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)及HYP質(zhì)量分數(shù)的影響 肝組織病理染色結(jié)果見圖4。HE染色結(jié)果顯示，對照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，可見存在大量的炎性細胞浸潤及組織壞死；YGJP-W各給藥組與陽性組炎性細胞浸潤及組織壞死較模型組均有不同程度改善，其中以YGJP-W 高劑量組改善效果最為顯著。SR 染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)可見少量膠原纖維沉積；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量膠原沉積，以匯管區(qū)為中心向四周呈發(fā)散狀分布；與模型組相比，YGJP-W 各給藥組與陽性組內(nèi)膠原沉積均有不同程度地減少，其中以YGJP-W 高劑量組的效果最為顯著。HYP 和SR半定量結(jié)果見圖5，與對照組相比，模型組肝組織內(nèi)HYP 質(zhì)量分數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，YGJP-W 各給藥組與陽性組HYP 質(zhì)量分數(shù)顯著下降（P＜0.05）。天狼星紅染色膠原半定量結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織膠原面積顯著增加（P＜0.01）；YGJP-W 高劑量組與陽性組膠原面積較模型組顯著下降（P＜0.05）。

圖4 小鼠肝組織病理HE 和SR 染色Fig. 4 HE and SR staining of liver tissue in mice

圖5 小鼠肝組織HYP 含量和SR 陽性面積 (±s, n = 7)Fig. 5 HYP content and SR positive area of liver tissue in mice (±s, n = 7)

3.2.3 對CCl4肝纖維化小鼠腸道菌群的影響 采用主成分分析（principal component analysis，PCA）比較對照組，模型組和YGJP-W 高劑量組之間的腸道菌群組成差異，通過提取3 組中各樣本的16s rDNA 序列的主成分因子，得到PCA 圖（圖6-A）可知，對照組和模型組基本可以分開，說明CCl4干預(yù)能夠?qū)π∈竽c道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，而模型組和YGJP-W 組也基本可以分開，說明YGJP-W能夠引起小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖6 YGJP-W 對CCl4 誘導(dǎo)小鼠腸道菌群的作用Fig. 6 Effects of YGJP-W on gut microbiota in CCl4-induced mice

接著，為了進一步解釋YGJP-W 對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生何種具體影響，分別在門級別和種級別評估YGJP-W 干預(yù)后的腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)。在門水平上（圖6-B～F），擬桿菌門（57.3±13.8）%是對照組的優(yōu)勢細菌門，其次是厚壁菌門（29.4±8.4）%、變形菌門（5.0±3.3）%和放線菌門（3.6±2.1）%。CCl4誘導(dǎo)能夠顯著增加了擬桿菌門的豐度[（79.3±8.1）%，P＜0.01]，減少了厚壁菌門 [（16.9±9.6）%，P＜0.05] 和放線菌門 [（0.3±0.1）%，P＜0.01] 的豐度，同時也減少了變形菌門[（2.1±1.9）%，P＞0.05] 的豐度，但不具有顯著性差異。YGJP-W 干預(yù)后，擬桿菌門（57.4±14.6）%，豐度顯著性降低（P＜0.01），幾乎回調(diào)到對照組水平，變形菌門（10.4±4.7）%和放線菌門（3.7±2.4）%豐度均顯著性升高（P＜0.01），提示YGJP-W 逆轉(zhuǎn)了CCl4導(dǎo)致的菌群變化。

在屬水平上，對豐度前30 的細菌進行了分析（圖6-G），線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）結(jié)果顯示（圖6-H），以lg LDA＞3.0 為閾值，與對照組相比，CCl4誘導(dǎo)顯著影響了9個細菌屬的豐度（LDA score＞3.0，P＜0.05），其中8 個屬,包括狄氏副擬桿菌屬Parabacteroides、毛螺菌屬NK4A136 組Lachnospiraceae_NK4A136_group、活潑瘤胃球菌屬Ruminococcus_gnavus_group、普雷沃氏菌科NK3B31 組（Prevotellaceae_NK3B31_group）、扁平絲菌屬Planifilum、梭桿菌屬Fusobacterium、乳桿菌屬Lactobacillus和巨單胞菌屬Megamonas的豐度降低，1 個菌屬，普雷沃氏菌（Prevotella_9）的豐度增加。YGJP-W 的干預(yù)影響了10 個細菌屬的豐度（LDA score＞3.0，P＜0.05），其中6 個細菌屬，包括狄氏副擬桿菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、活潑瘤胃球菌屬、薩特氏菌屬Sutterella、毛螺菌屬NK4A136 組和梭桿菌屬的豐度增加，4 個細菌屬包括擬普雷沃氏菌屬Alloprevotella、腸鼠桿菌屬Muribaculum、普雷沃氏菌屬UCG-001Prevotellaceae_UCG-001 和另枝桿菌Alistipes的豐度降低。

3.3 YGJP-W對菌群耗竭后CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用

3.3.1 對血清肝功能的影響 血清生化結(jié)果見圖7。與對照組組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL 和TBA 顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，YGJP-W 組血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL 和TBA 均有不同程度降低（P＜0.05、0.01）。抗生素耗竭后，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL 和TBA 顯著升高（P＜0.05、0.001）；然而，與模型加抗生素組相比，YGJP-W 加抗生素組組不能顯著降低血清ALT、AST、TBIL、DBIL、IBIL和TBA。結(jié)果提示YGJP-W 改善血清肝肝功能為菌群依賴性。

圖7 YGJP-W 對菌群耗竭后CCl4 誘導(dǎo)肝纖維化小鼠血清生化的影響 (±s, n = 7)Fig. 7. Effects of YGJP-W on serum biochemistry in CCl4-induced liver fibrosis mice after bacterial depletion (±s, n = 7)

3.3.2 對CCl4肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)及HYP含量的影響 肝組織病理染色結(jié)果見圖8。HE 染色結(jié)果顯示，對照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，可見存在大量的炎性細胞浸潤及組織壞死；YGJP-W 組炎性細胞浸潤及組織壞死較模型組改善效果顯著。SR染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)可見少量膠原纖維沉積；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)大量膠原沉積，以匯管區(qū)為中心向四周呈發(fā)散狀分布；與模型組相比，YGJP-W 組肝組織內(nèi)膠原沉積顯著減少。HYP 和SR 半定量結(jié)果見圖9，與對照組相比，模型組肝組織內(nèi)HYP 質(zhì)量分數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，YGJP-W 組HYP 含量顯著下降（P＜0.05）。天狼星紅染色膠原半定量結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織膠原面積顯著增加（P＜0.001）；YGJP-W 組膠原面積較模型組顯著下降（P＜0.05）。HE 染色結(jié)果顯示，抗生素耗竭后，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴重破壞，存在大量的炎性細胞浸潤及組織壞死；YGJP-W 加抗生素組炎性細胞浸潤及組織壞死較模型加抗生素組并無顯著改善。SR 染色結(jié)果顯示，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組小鼠肝組織存在大量膠原沉積，且YGJP-W 加抗生素組肝組織內(nèi)膠原沉積并未得到改善。HYP和SR 半定量結(jié)果見圖9，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組的肝組織內(nèi)HYP 質(zhì)量分數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型加抗生素組相比，YGJP-W加抗生素組HYP 質(zhì)量分數(shù)并未顯著下降（P＞0.05）。天狼星紅染色膠原半定量結(jié)果顯示，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組小鼠肝組織膠原面積顯著增加（P＜0.001）；YGJP-W 加抗生素組膠原面積較模型加抗生素組并未顯著下降（P＞0.05），同樣提示YGJP-W 抑制膠原沉積作用為菌群依賴性。

圖8 小鼠肝組織病理HE 和SR 染色Fig. 8 HE and SR staining of liver tissue in mice

圖9 小鼠肝組織HYP 含量和SR 陽性面積 (±s, n = 7)Fig. 9 Hyp content and SR positive area of liver tissue in mice (±s, n = 7)

3.3.3 對CCl4肝纖維化小鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和CoL-I 表達的影響 Real-time PCR 結(jié)果見圖10，與對照組比較，模型組小鼠肝組織α-SMA和CoL-ImRNA表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，YGJP-W 組小鼠肝組織α-SMA和CoL-ImRNA 表達水平有不同程度降低（P＜0.01、0.05）。抗生素耗竭后，與對照加抗生素組相比，模型加抗生素組小鼠肝組織α-SMA和CoL-ImRNA 表達水平顯著升高（P＜0.001）；然而，與對照加抗生素組相比，YGJP-W 加抗生素組不能降低小鼠肝組織α-SMA和CoL-ImRNA 表達水平（P＞0.05），結(jié)果提示YGJP-W 抑制肝纖維化為菌群依賴性。

圖10 小鼠肝組織α-SMA 和CoL-I mRNA 表達 (±s, n = 7)Fig. 10 α-SMA and CoL-I mRNA expression of liver tissue in mice (±s, n = 7)

4 討論

多糖是一類廣泛存在于中藥中的高分子聚合物，現(xiàn)代研究已證明多糖是中藥中一類重要的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，表現(xiàn)出包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、改善糖脂代謝、保肝以及抗病毒在內(nèi)的多種功能[23-25]。中藥湯劑因其制法簡便，見效迅速的優(yōu)勢，是中藥最常用和最經(jīng)典的劑型之一。長期以來，關(guān)于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究多集中在各類親脂性小分子成分，例如生物堿、黃酮、萜類等，多糖作為中藥湯劑中主要存在的一類生物活性大分子物質(zhì)，由于技術(shù)及認識的局限，研究相對缺乏。本研究關(guān)注一貫煎的多糖類成分，并從中制備得到活性多糖YGJP-W，其得率高達11.60%，藥效學(xué)實驗表明YGJP-W 具有顯著的抗肝纖維化活性，提示多糖類成分YGJP-W 是一貫煎的重要活性物質(zhì)基礎(chǔ)之一。YGJP-W 是由YGJP 過弱陰離子交換樹脂，經(jīng)水洗脫所得，由于糖醛酸能夠被弱陰離子交換樹脂吸附，水的離子強度低，只能將中性糖洗脫，很難將糖醛酸洗脫。本研究中，糖醛酸檢測，單糖組成分析及FT-IR 分析檢測結(jié)果均說明YGJP-W 為中性多糖，幾乎不含糖醛酸，與分離流程相一致，同時說明YGJP 在弱陰離子交換樹脂的上樣量合理，不存在過載行為。化學(xué)分析顯示YGJP-W 是由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖構(gòu)成，其物質(zhì)的量比為1.0∶2.8∶1.4∶1.6，葡萄糖和果糖是YGJP-W 中含量最多的2 類單糖。考慮到葡聚糖是北沙參中的特征性多糖，果聚糖是麥冬中的特征性多糖，因此，我們合理地推測YGJP-W 中含有葡聚糖和果聚糖類，而半乳糖和甘露糖則可能以不同類型的雜多糖的形式存在。但需要注意的是，一貫煎由生地黃、北沙參、麥冬、當(dāng)歸、枸杞和川楝子組成，該6 味中藥中含有的多糖被報道由各種不同類型的單糖組成，除了上述4 種，還含有阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等，但這些單糖沒有在YGJP-W 中檢測到，推測可能轉(zhuǎn)移到Y(jié)GJP-0.2 或YGJP-0.5 部分，但這個問題是否涉及到多糖類成分在中藥配伍共煎過程中的變化，還有待進一步研究闡明。

鑒于多糖口服吸收利用率低，其代謝途徑有待進一步闡明，關(guān)于多糖口服后如何發(fā)揮藥理活性是困擾多糖研究的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。近年來，越來越多的研究證實腸道菌群與多種疾病密切相關(guān)，通過影響腸道菌群能夠改善多種疾病已得到明確[26]。多糖是調(diào)節(jié)腸道菌群的重要物質(zhì)，因此，腸道菌群為中藥多糖的作用機制研究提供了一條重要途徑。為了解釋YGJP-W 對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的干預(yù)作用與調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)，對YGJP-W 干預(yù)后的小鼠菌群進行了分析。本研究雖然發(fā)現(xiàn)了YGJP-W能夠逆轉(zhuǎn)CCl4引起的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，并通過抗生素聯(lián)合YJGP-W 干預(yù)實驗證明了YJGP-W 發(fā)揮抗肝纖維化的作用可能與其調(diào)控腸道菌群相關(guān)。但是YJGP-W 具體是怎樣通過調(diào)控腸道菌群發(fā)揮活性還不清楚，是通過影響腸道菌群的代謝產(chǎn)物，包括短鏈脂肪酸，長鏈脂肪酸，膽汁酸，支鏈氨基酸等發(fā)揮活性？還是YJGP-W 被腸道菌群酵解后進而直接發(fā)揮活性？有待進一步研究闡明。本研究中十分值得關(guān)注的是在16S rRNA 測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，在所有菌屬中，狄氏副擬桿菌屬Parabacteroides變化最為顯著。與對照組相比，模型小鼠糞便中狄氏副擬桿菌屬明顯減少，YGJP-W 可回調(diào)這種變化。已有研究報道狄氏副擬桿菌Parabacteroides distasonis可有效抑制小鼠NASH[27]；改善小鼠代謝綜合征和肥胖癥[28]；補充狄氏副擬桿菌可通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝改善硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）和蛋氨酸膽堿缺乏飼料（methionine-and choline deficient diet，MCD）飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化[29]、增加未結(jié)合的膽汁酸，如UDCA 和LCA 和盲腸內(nèi)容物中的BSH 活性[30]；臨床研究報告NAFLD、新生兒膽汁淤積疾病患者和肝纖維化患者腸道中狄氏副擬桿菌水平降低[31]；這些已報道的研究均表明增加狄氏副擬桿菌可有效減輕慢性肝病的嚴重程度，延緩疾病進展，而本研究提示一貫煎YGJP-W 可能通過增加腸道狄氏副擬桿菌等改善肝纖維化，但該問題也有待下一步研究證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突