基于生物信息學分析HOXC9在神經母細胞瘤中的表達及臨床應用

孫苗苗 張大△ 劉亞玲 楊洋

1)鄭州大學第一附屬醫院小兒外科 鄭州 450000;2)河南濮陽市人民醫院 濮陽 457000

神經母細胞瘤 (Nuroblastoma, NB)是兒童常見的顱外實體腫瘤,占兒童腫瘤的8%～10%,90%發生于5歲以下的兒童[1]。NB起源于交感神經的神經嵴祖細胞[2],其中絕大部分發生于腎上腺髓質或腹部交感神經節,小部分發生于頸部、胸部或盆腔的交感神經節。NB具有生物學異質性,惡性度高,早期易轉移[3],并具有自發消退及體外誘導分化的獨特生物學特性,尤其在4 S期患兒中較易發生[4]。目前對NB的發病機制仍未完全明確。本研究應用生物信息學方法,篩選出HOXC9差異基因,并采用Q-PCR法驗證其在腫瘤組織中的表達,為探討NB的發生、發展機制和臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2021-01—2023-02在我院小兒外科行手術的28例NB、8例節神經母細胞瘤(GNB)、6例節神經細胞瘤(GN)患兒的臨床資料和手術切除標本。納入標準:初治患兒且在我院行手術治療。病理結果經組織病理學證實。排除標準:合并其他腫瘤和免疫缺陷病患兒。未經系統治療或失訪者。本研究已經院倫理委員會審批(倫理號:2023-KY-0697),患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法下載TARGET數據庫的NB數據及臨床資料,分析NB中不同危險度間差異表達基因(differential expression genes,DEGS);富集分析差異基因參與的基因本體論(Gene ontology,GO)系統和KEGG通路,結合STRING數據庫構建與基因相關的PPI關系對,采用K-M法和Log-rank檢驗分析PPI網絡中的基因在各個樣本中的表達值與預后信息之間的關系[5]。以HOXC9為目的基因,GAPDHA為內參基因,采用實時熒光定量PCR SYBR Green I方法檢測腫瘤組織中HOXC9基因mRNA水平表達情況。

1.3 檢測指標采用實時熒光定量PCRSYBR Green I方法檢測NB、GNB、GN中HOXC9 mRNA表達水平,分析其表達水平與NB不良預后的關系。

1.4 統計學方法將GN組設為對照組,采用(2-△△Ct 法)將CT值標化后,采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計學分析。多組獨立定量資料,采用Kruskal-Wallis檢驗;兩組獨立定量資料,采用Mann-Whitney檢驗。設定=0.05,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學分析根據臨床數據,將樣本分為高、中、低風險3組。閾值設定: P.Val<0.05 &|logFC|>1,篩選出差異表達基因,各組差異基因的數目如表1。將3組差異基因取并集,得到681個并集基因。見圖1。

圖1 差異基因取并集韋恩圖

表1 差異基因數目統計

表2 HOXC9在 High vs Medium、High vs Low差異表達情況

將差異基因結合RNA-seq數據表達矩陣,使用Stem軟件進行表達趨勢聚類分析,設置clustering method: STEM Clustering Method, significance level:0.05,得到模塊基因集,見圖2。利用富集分析工具DAVID6.8分析差異基因參與的基因本體論(GO)系統和KEGG通路。設置顯著性閾值P<0.05且富集個數(count)至少為2,可見差異基因與信號傳導、神經系統發育、細胞分化顯著相關。

圖3 差異基因的GO和KEGG富集結果(從上到下依次是High vs Medium、 Medium vs Low、High vs Low,條形長度表示富集基因個數,顏色從藍到紅表示顯著性P.Value值的減小,顯著性更高)

結合STRING10.0數據庫預測分析HOXC9編碼蛋白之間是否存在互作關系。輸入基因集為所有關鍵模塊基因,物種為Homo Sapiens。設置參數PPI score設為0.9 (highest confidence),通過將患者按照其表達值的中位值分為高、低表達組,進行K-M生存曲線繪制,同時采用Log-rank檢驗值,篩選出差異基因HOXC9(P<0.05)。生存曲線如圖4。

圖4 HOXC9基因K-M生存曲線圖

圖5 HOXC9的相對表達水平注:A.HOXC9在NB、GNB、GN中的表達采用K-W檢驗,χ2=7.460,P=0.0240。B.HOXC9在NB+GNB、GN間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=-1.348,P=0.0070。C.HOXC9在不同分期的表達采用K-W檢驗χ2=7.722,P=0.0521。D.HOXC9在不同危險度間的表達采用 K-W檢驗,χ2=12.93,P=0.0016。E.HOXC9在有無MYCN基因擴增的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.5423,P=0.020。F.HOXC9在有無骨轉移之間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.1644,P=0.3853。G.HOXC9在有無骨髓浸潤之間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.1816,P=0.99。H.HOXC9在有無淋巴結轉移的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.6799,P=0.0634。I.確診年齡(月)與HOXC9表達的散點圖,簡單線性回歸,F=22.74,P<0.001,R2=0.3871)

2.2 Q-PCR結果HOXC9在不同病理類型的腫瘤中,GN組表達水平高,NB組的表達水平低,差異有統計學意義(P<0.05)。HOXC9在不同危險度分層中,低危組表達水平高,差異有統計學意義(P<0.05),HOXC9在有MYCN基因擴增中,有MYCN擴增組表達低(P<0.05)。HOXC9在不同分期、有無骨轉移、有無骨髓浸潤及有無淋巴結轉移的表達差異無統計學意義(P>0.05)。繪制確診年齡(月)與HOXC9表達的散點圖,采用簡單線性回歸分析,回歸系數檢驗P<0.05,回歸方程成立,HOXC9表達水平=-0.01395×確診年齡+1.399,即HOXC9表達水平與確診年齡呈負相關。

3 討論

HOXC9基因是發育基因,屬于同源異型盒(Homebox)家族成員。在胚胎發育時期,在特定的空間位置以時間先后表達或沉默,控制胚胎結構的發育[6]。研究表明,HOXC9基因除調節胚胎發育外,也與多種惡性腫瘤的發生、發展和預后密切相關[7],參與細胞的增殖、分化、凋亡、神經系統發育等生理過程。

國際神經母細胞瘤分期系統(international neuroblastoma staging system,INSS)是使用最廣泛的分期方法,根據確診年齡、分期、組織病理類型、生物學特征等[8]對疾病危險程度進行分組。但小部分腫瘤可以自發消退或良性轉化。自發消退是指在極少甚至無系統治療的情況下腫瘤自行縮小乃至消失,良性轉化是指腫瘤可由惡性程度高的NB轉化為節GNB[9-10]。研究表明,NB自發消退可能與年齡[11]、腫瘤部位[12-13]、組織學特征[14]、分子生物學基礎等因素有關。但目前NB自發消退及良性轉化的調控機制尚不明確。

本研究中,HOXC9在良性GN中的表達水平高,在惡性NB中的表達水平低,在低危險度分層組的表達水平高。即,HOXC9的表達水平與腫瘤的惡性程度相關,危險度越高,惡性程度越高。HOXC9表達水平越低,細胞分化越差。據報道,HOXC9可誘導細胞分化并使NB的自我更新能力降低[15],因此HOXC9可能通過誘導神經元分化及控制細胞周期調控NB自發消退或良性轉化進程。HOXC9在MYCN基因擴增組中表達低,在NB患兒中,22%的患者伴有MYCN基因擴增,或染色體1p32雜合性丟失,伴有這些基因突變的患兒預后大都較差[16-17];而MYCN基因不擴增的患兒預后較好。MYCN基因可誘導NB細胞分化,用RA治療后NB細胞的形態學分化伴隨著許多HOX基因表達的增加[18],因此HOXC9可能通過調控MYCN控制NB細胞分化。HOXC9表達水平與確診年齡呈負線性相關,年齡越小,HOXC9表達越高,且患兒確診年齡是NB的獨立危險因素[19],年齡越大提示預后越不良。年齡是自發消退或良性轉化的影響因素,與HOXC9可能誘導NB細胞分化調控自發消退或良性轉化進程一致。

本研究中,HOXC9在不同分期、有無骨轉移、有無骨髓浸潤,以及有無淋巴結轉移等病理特征中的表達差異無統計學意義,可能與樣本量太少及選擇偏倚有關。生物信息學分析顯示,HOXC9與腫瘤神經元分化、細胞分化相關。Q-PCR分析HOXC9表達低與差的分期、高的危險度、MYCN擴增相關,提示預后不良,可能與神經母細胞瘤良性分化或自發消退有關,可為NB診療提供新的依據。

本研究只進行Q-PCR驗證HOXC9 mRNA水平的表達,收集的臨床數據時間較短,缺少生存分析。后續將進行蛋白質水平驗證,進一步探索HOXC9的具體調控機制。