臨床腹瀉豬空腸組織中腎素-血管緊張素系統(RAS)的表達變化及與腸道炎癥的關系

陳雪清,李志強,吳雨龍,張崇昊,張源淑*

(1.南京農業大學 農業部動物生理生化重點開放實驗室,南京 210095;2.南京曉莊學院食品科學學院,南京 211171)

腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)作為重要的體液調節系統,在全身或各器官的局部調節多種機體功能,如在全身或血液循環中主要參與調控血壓、維持心血管功能穩態、電解質和體液平衡等;而在局部或組織中則以調節多種器官的功能為主,如心、肝、腎以及肺等。經典RAS諸多成分已被證實存在于胃腸道中,并對體液、電解質、葡萄糖和肽的分泌及吸收、胃腸蠕動和腸系膜血液循環等一系列過程產生功能性影響[1]。近年來,研究發現,RAS新的調控因子——血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)可促進腸黏膜吸收消化多肽,維持腸道微生態平衡[2-3];ACE2的水解產物Ang(1-7)可通過降低MAPK和NF-κB信號通路的活性抑制炎癥性腸病(IBD)的發展[4],這表明,RAS相關成分特別是ACE2在維護腸道健康方面具有積極作用。

ACE2作為血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的同系物,是RAS發揮作用的主要成員。自2000年首次發現以來,多項研究結果表明,ACE2在抗組織炎癥損傷方面展現出巨大潛力,其主要通過降解Ang Ⅱ產生Ang(1-7),參與血壓調節、人體水鹽代謝平衡和抗組織纖維化等過程,具有顯著的抗炎抗纖維化功能[5-7]。作為RAS中新的ACE2-Ang(1-7)-MasR通路的核心酶,ACE2一方面作為抗炎蛋白降解Ang Ⅱ以緩解或抵抗Ang Ⅱ介導的炎癥反應;另一方面通過其下游產物Ang(1-7)激活MasR發揮抗炎作用[8]。這表明RAS具有雙重調節功能,既能通過ACE-Ang Ⅱ-AT1R途徑發揮收縮血管、損傷黏膜的作用,又能通過ACE2-Ang(1-7)-MasR途徑發揮擴張血管、抑制炎癥等抗損傷的作用[9]。另外,空腸是豬營養吸收的主要腸段,以腹瀉為主要癥狀的腸道炎性病變極大破壞了腸道屏障,嚴重影響生豬的生長發育。目前,ACE2的研究主要集中在人和嚙齒類動物,關于豬腸道健康的研究不多,特別是通過調控ACE2影響RAS的平衡來探究其與腸道穩態的關系更是缺乏。本研究以臨床上出現腹瀉癥狀的保育豬的空腸為研究對象,通過組織病理學及對空腸組織相關炎性因子檢測明確由于臨床中普遍出現的腹瀉癥狀而導致的空腸炎癥性損傷,同時觀察此情況下其空腸局部RAS相關組分特別是ACE2的表達變化,探究RAS與腹瀉豬空腸炎癥的相互關系,從而為腸道局部ACE2的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑和儀器 4%多聚甲醛(南京鼎國昌盛生物技術有限公司);3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB,江蘇凱基生物技術股份有限公司);Trizol試劑盒(日本TaKaRa公司);RNA抑制劑(美國Promega公司);PVDF膜(美國Millipore公司);豬血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、豬血管緊張素1-7(Ang 1-7)、豬腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素(IL-10)ELISA試劑盒(南京奧青生物技術有限公司)等。

石蠟切片機(RM2235,德國徠卡公司);顯微鏡(BH-2,日本奧林巴斯株式會社);高速冷凍離心機(Mikro-22R,德國Andreas公司);核酸蛋白測定儀(BioPhotometer D30,德國Eppendorf公司);PCR儀(Tpersonral,美國Biometra公司);電泳儀及半干轉印儀(Power pac300,美國BIO-RAD公司);全自動發光成像系統(Tanon-5200 Multi,上海天能科技有限公司)等。

1.1.2 試驗動物及樣品采集 試驗所需動物樣本來源于江蘇梅林公司華明豬場40～50日齡保育蘇姜母豬。挑選健康和臨床表現出嚴重腹瀉癥狀的保育豬分組分欄并進行隔離飼養,每組6只,共兩組,期間自由采食和飲水。分別對健康保育豬和患有嚴重水樣腹瀉癥狀且瀕臨死亡的保育豬頸部放血處死。截取空腸組織并用0.9%氯化鈉溶液漂洗,將其中一部分迅速移入液氮中,于-80 ℃保存;另一部分(空腸前、后段)被截取為0.5 cm3左右的組織塊并移入4%多聚甲醛,室溫保存。

1.2 方法

1.2.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中相關炎性因子含量的測定 ELISA法檢測腹瀉保育豬以及正常保育豬空腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-10和Ang II、Ang(1-7)的含量。首先稱取100 mg空腸組織于1 mL預冷裂解液中勻漿,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,取上清。按照ELISA檢測試劑盒說明檢測相關指標含量變化,根據所測標準品OD450 nm值繪制標準曲線,根據標準曲線方程得出樣品濃度(TNF-α、IL-1β、IL-10單位:ng·mL-1;Ang II、Ang(1-7)單位:pg·mL-1),并對最終數據進行分析。

1.2.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織病理學切片制作 首先用4%多聚甲醛固定豬的空腸組織樣品,然后將組織樣品于固定液中固定24 h或更久,接著取出組織樣品分別在固定液、80%酒精、90%酒精、95%酒精和無水乙醇條件下依次梯度脫水,將其放入二甲苯中浸泡并進行浸蠟包埋處理,包埋好的組織冷卻后切片(3 μm)并做標記進行HE染色,最后用中性樹膠做封閉處理,于顯微鏡下觀察。

1.2.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織ACE2、MasR基因的RT-qPCR檢測

1.2.3.1 空腸組織總RNA的提取:取臨床表現出腹瀉癥狀的保育豬及正常保育豬的空腸組織約100 mg,徹底勻漿,采用Trizol一步法抽提以上腸段組織的總RNA,以紫外比色法測定總RNA的濃度和純度。

1.2.3.2 反轉錄:根據測得空腸組織的總RNA濃度,用DEPC水統一濃度至500 ng·mL-1。選擇完整性好且A260 nm/A280 nm/為1.8～2.0的RNA,采用二步法反轉錄成cDNA。

1.2.3.3 目的基因引物設計:根據GenBank上公布的豬ACE2、Mas受體及β-Actin內參基因序列,用Primer Premier 5軟件自行設計引物(表1),由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.2.3.4 Real-time PCR檢測:以β-Actin為內參,采用熒光定量PCR SYBR Green染料對ACE2、Mas受體基因進行相對定量分析。反應條件為95 ℃ 預變性 2 min;95 ℃ 變性5 s,60 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,共40個循環,利用相對定量ΔΔCt法進行數據統計。

1.2.4 臨床腹瀉保育豬空腸組織RAS相關組分的變化

1.2.4.1 空腸組織中RAS相關組分蛋白表達的Western blot分析:稱取100 mg仔豬空腸組織于1 mL裂解液中勻漿,離心取上清,按照“試劑A∶試劑B=50∶1的比例”配制 BCA工作液,酶標儀測定A562nm,根據標準曲線得出蛋白濃度。以120 V,90 min的條件SDS-PAGE電泳,以1.5 mA·cm-2、90 min的條件轉印,5%脫脂奶粉液中封閉2 h,先后孵育一抗(ACE2∶1∶3 000;MasR/ACE/AT1R∶1∶2 000;4 ℃過夜)和二抗(室溫2 h),抗體孵育按試劑盒說明書進行,避光條件下滴加AB顯色液顯色5 min并拍照,以GAPDH作內參,目的條帶與其相比得到相對量。

2 結 果

2.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中相關炎性因子的變化

相關炎性因子檢測結果如圖1所示。與正常豬相比,表現臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中促炎性因子TNF-α、IL-1β的含量顯著升高(P<0.05);其空腸組織中抗炎性因子IL-10有下降的趨勢,但無顯著性。

2.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織形態學變化

空腸組織形態學觀察結果如圖2所示。相比于臨床腹瀉豬,正常豬空腸組織結構相對完整,腺體正常。表現臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織不完整,腸絨毛壞死脫落(4×視野,圖2A),腸腺上皮細胞增生(10×視野,圖2A),腸絨毛內部結構遭到嚴重破壞(40×視野,圖2A)。當發生嚴重腹瀉時,保育豬空腸可見水樣黏液,腸腺濃染(4×視野,圖2B),空腸結構被嚴重破壞,腸絨毛腫脹(10×視野,圖2B),并伴有大量出血點(40×視野,圖2B)。

A. 腹瀉豬空腸;B. 重度腹瀉豬空腸;C. 正常豬空腸。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖A. Jejunum of piglets with diarrhea; B. Jejunum of piglets with severe diarrhea; C. Normal piglet jejunum. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article

與正常豬相比,*表示差異顯著(P<0.05)Compared with normal piglets, * indicated that the difference was significant (P<0.05) 圖1 空腸組織中炎性因子的含量(n=6)Fig.1 Contents of inflammatory factors in pig jejunal tissues (n=6)

2.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2、MasR mRNA表達

ACE2是RAS系統中關鍵的調控因子,其發揮作用主要依賴于下游Ang(1-7)和Mas受體,探究發生腸道炎癥的空腸組織中ACE2與Mas受體變化對于后續研究尤為重要。結果如圖3所示。與正常保育豬相比,表現臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織ACE2 mRNA水平下調,但無顯著性(P>0.05);ACE2下游受體MasRmRNA水平相比于正常豬極顯著下降(P<0.01)。

與正常豬相比,**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with normal piglets,** indicate that the difference was very significant (P<0.01)

2.4 臨床腹瀉保育豬空腸組織中RAS相關組分含量及蛋白的表達

2.4.1 臨床腹瀉保育豬空腸組織中Ang II、Ang(1-7)含量的變化 結果如圖4所示。與正常豬相比,表現臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中Ang Ⅱ 含量升高,而Ang(1-7)含量降低。

圖4 空腸組織中Ang Ⅱ和Ang(1-7)含量(n=6)Fig.4 Contents of Ang Ⅱ and Ang (1-7) in jejunal tissues (n=6)

2.4.2 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2、MasR、ACE和AT1R蛋白的表達 Western blot結果如圖5A、B所示。灰度分析發現:表現臨床腹瀉癥狀的保育豬空腸組織中ACE2蛋白水平顯著低于正常豬(P<0.05)(圖5C),Mas受體蛋白水平極顯著低于正常豬(P<0.01)(圖5D),蛋白水平結果與mRNA結果一致,這說明在腸道炎癥狀態下ACE2水平的表達下調,其下游受體Mas表達下調。為了探究豬腹瀉性腸道炎癥與RAS經典軸的關系,繼續檢測另一條軸ACE和AT1R的蛋白表達,結果如圖5E、F所示。ACE和AT1R蛋白在臨床腹瀉保育豬空腸組織中的表達均極顯著高于正常豬(P<0.01)。

與正常豬相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with normal piglets, * indicate that the difference was significant (P<0.05),** indicate that the difference was very significant (P<0.01)

2.4.3 臨床腹瀉保育豬空腸組織中ACE2/ACE蛋白表達比值分析 RAS中ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸與ACE2-Ang(1-7)-MasR軸發揮兩種截然不同的作用。本研究分別將正常與表現臨床腹瀉癥狀的豬空腸組織中ACE2與ACE蛋白表達進行比較分析,發現在正常豬中ACE2/ACE比值大于1(圖6),說明此時ACE2表達占優勢,ACE表達占劣勢,ACE2-Ang(1-7)-Mas軸發揮主要的作用。而在表現臨床腹瀉癥狀的保育豬中,ACE2/ACE比值小于1,說明此時ACE2表達占劣勢,ACE表達占優勢,符合炎癥發生時ACE出現上調的趨勢,且此時ACE-Ang Ⅱ-AT1軸發揮主要作用。

圖6 ACE2/ACE比值分析(n=6)Fig.6 Ratio analysis of ACE2/ACE (n=6)

3 討 論

我國不僅是農業大國,同時也是世界養豬生產的第一大國,無論是生豬養殖規模還是豬肉消費量均居世界第一。尤其是近年來,我國養豬業在技術水平,規模化程度,動物福利研究等方面均取得一定的進展,但仍面臨諸多挑戰。隨著集約化養殖模式的發展與流行,各種細菌性、病毒性疾病嚴重危害生豬養殖業。其中保育豬需要經過仔豬斷奶后變料至育肥階段,在這一階段豬自身消化系統發育尚未完全成熟且對環境適應性較差,加之斷奶、變溫、換舍和換料等應激,極易誘發消化道疾病,引發生豬不同程度的感染,最終導致仔豬出現以腹瀉為主要癥狀的慢性腸道炎癥,影響仔豬生長存活率和集約化養殖的整體效益[10]。腹瀉是多種疾病發生發展過程中具有的共同現象,由于腸黏膜屏障損傷以及炎癥介質過度釋放等直接介導腸道炎性損傷的發生,通常表現為腹瀉,精神沉郁,個體弱小,嚴重時甚至死亡[11-12]。本文以臨床上出現腹瀉癥狀的保育豬為研究對象,通過分析其空腸組織病理學變化及相關炎性因子的表達,證實臨床中表現出的腹瀉癥狀最終能夠誘發嚴重的空腸組織病變,主要表現在腸絨毛壞死脫落,腸腺上皮細胞大量增生,腸內伴有出血點,炎癥因子大量釋放,空腸結構遭到嚴重破壞。這極大地威脅了保育豬的生長發育。

一直以來,腎素-血管緊張素系統都在血壓調節,水鹽代謝等發面發揮重要作用。自2012年Hashimoto等[13]發現ACE2對抑制腸道炎癥、維持腸道穩態、保護腸道健康等方面同樣具有積極的影響后便開啟了ACE2在腸道炎癥方面的新篇章。Yisireyili等[14]發現腸道炎癥過程中ACE2具有抗炎且促進氨基酸代謝吸收的功能。Garg等[15]發現在腸炎患者體內,RAS經典成員(ACE、Ang Ⅱ、AT1)的含量與對照組相比無顯著性差異,而新成員ACE2、Ang(1-7)的表達上調,且Ang(1-7)的表達水平與血小板和白細胞數量呈正相關,提示ACE2和Ang(1-7)具有作為腸道炎癥的生物標志物的潛力。

ACE2作為RAS中的關鍵酶及中性氨基酸轉運載體的穩定劑,對控制腸道炎癥具有重要作用。越來越多的研究表明 ACE2對腸道炎癥反應具有負向調節作用,主要通過水解Ang II,生成Ang (1-7),從而減少細胞因子的釋放、組織損傷及纖維化,并與Mas受體結合發揮抗炎和抗增殖的作用[16]。本研究通過仔豬腹瀉性空腸炎癥變化也發現,由ACE-Ang II-AT1R軸與ACE2-Ang(1-7)-MasR軸構成的RAS平衡被打破,腹瀉誘發空腸炎性損傷,并激活ACE-Ang II-AT1R軸。此時,空腸內負責水解Ang II并維持其平衡的ACE2受到抑制,過量的Ang II被釋放出來,沒有足夠的Ang(1-7)與下游Mas受體結合,這進一步導致炎癥反應加劇。

目前,ACE2的研究多局限于人和嚙齒類動物,在豬上的研究相對遲緩,最早是Yang等[17]研究發現,B0AT1與ACE2可通過特殊的調控機制在仔豬完整的小腸隱窩-絨毛軸表達,B0AT1基因通過完整的隱窩-絨毛軸在上皮轉錄以及與ACE2在頂點膜上的共表達導致腸段Na+-中性氨基酸吸收活性增強,這對促進腸道營養物質吸收,維護腸道健康具有積極影響。本研究發現腹瀉可導致保育豬腸道增生性炎癥以及腸內Ang II過表達,會加速炎癥反應的發生,RAS相關組分均處于激活狀態,ACE介導的ACE-Ang II-AT1R軸處于優勢,而ACE2及其下游介導的ACE2-Ang(1-7)-MasR軸處于劣勢。因此,作者認為ACE2作為ACE的拮抗劑發揮抑制腸道炎癥的功能。另外,根據已有的研究結果可以推測ACE2是腸道微生態穩定、氨基酸平衡、先天免疫以及腸道炎癥易感性的關鍵調控因子,可能參與并維持腸道的微生態平衡,對維持腸道穩態具有積極的作用,這方面的研究值得開展。但就目前檢索的結果來看,ACE2在胃腸道方面的研究結果還不是很多,特別是在豬上的研究較少,由于豬消化道如仔豬腹瀉、育肥豬增生性腸炎等疾病一直都是養豬業主要解決的問題,因此,還需要進行更深入的研究。

4 結 論

臨床腹瀉保育豬空腸組織局部RAS被激活,ACE-Ang II-AT1R軸的活性遠高于ACE2-Ang(1-7)-MasR軸,ACE2抗炎性損傷作用處于劣勢。