酵母表面展示技術在食品發酵領域的應用研究進展

李悅,姬翔,李顏,井蕾,牛明福,李陽,2*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471000) 2(食品微生物河南省工程技術研究中心,河南 洛陽,471000)

微生物細胞表面不僅是胞內物質與胞外環境之間的邊界,也是胞內與胞外通信、分子識別及交換場所[1]。因此,細胞表面工程是微生物學研究與應用中最具吸引力的領域之一。1985年,SMITH最先報道將外源DNA片段插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ中,表達的融合蛋白被展示在病毒顆粒表面,而不影響噬菌體的感染能力,由此開啟了表面展示技術的發展[2]。表面展示技術可以將靶蛋白直接或間接地定向表達于微生物表面,展示的靶蛋白仍具備相對獨立的生物活性和空間構型,被廣泛用于疫苗和抗體開發、蛋白定向進化、生物傳感器、生物吸附、生物轉化、全細胞催化劑制備等方面[3]。

目前,病毒、細菌、酵母菌以及絲狀真菌等微生物表面展示系統相繼建立和發展。由于病毒和原核細胞展示系統缺乏蛋白質翻譯后的加工機制,部分細菌和絲狀真菌會產生內毒素等[4],限制了以上種類的表面展示技術在其食品和藥品等領域中的應用。酵母菌作為單細胞真核宿主,易于進行遺傳學操作,能夠實現重組蛋白正確折疊和糖基化等翻譯后修飾,可以利用廉價底物進行生物轉化和高密度培養。通過酵母表面展示技術能將功能酶錨定表達在酵母細胞表面制備全細胞催化劑,無需額外的純化和固定化操作,且與游離酶相比具有更好的溫度、pH值和有機溶劑穩定性,可以重復循環利用[5]。因此,與其他微生物表面展示系統相比,酵母展示系統更適合在食品領域應用。

本文對酵母表面展示技術的原理及其應用進展進行了概述,包括改善傳統發酵食品品質、改進發酵生產過程、發酵生產功能食品等方面;并展望了酵母表面展示技術的未來發展方向,以期為食品發酵技術革新和工業化應用提供參考。

1 酵母表面展示技術原理

酵母菌的細胞壁主要由甘露糖蛋白和β-葡聚糖組成,還含有少量幾丁質。以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為例,細胞壁分為內外2層(圖1)。內層是由β-1,3-葡聚糖和幾丁質構成的骨架,提供細胞壁的強度,骨架的側鏈成分為β-1,6-葡聚糖。外層是刷狀的甘露糖蛋白層,甘露糖蛋白與大多數的細胞表面特性相關聯。甘露糖蛋白被高度糖基化,直接或間接與β-1,3-葡聚糖骨架相連[6](圖1)。

圖1 酵母細胞壁結構示意圖

酵母表面展示系統的三要素是宿主、錨定蛋白和靶蛋白。位于酵母細胞表面的細胞壁蛋白或細胞膜蛋白是酵母表面展示系統的備選錨定蛋白。錨定蛋白通常含有信號肽和錨定結構域,靶蛋白與錨定蛋白“融合”表達后,信號肽將引導融合蛋白向細胞表面運輸,錨定結構域使融合蛋白固定在宿主細胞表面[7]。錨定蛋白的選擇對靶蛋白展示的成功率和效率起到關鍵作用。目前已被廣泛應用的酵母表面展示錨定蛋白主要是三類細胞壁蛋白(圖2)。第一類錨定蛋白以非共價鍵與細胞壁結合,通過簡單的SDS抽提即可獲得,如具有絮凝功能的Flo1p等。由于Flo1p的錨定結構域位于N端,靶蛋白的融合方式為C端融合。第二類錨定蛋白是通過糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨與細胞壁結合的GPI型蛋白,如Cwp1p、Cwp2p、Tip1p、Sed1p、α-凝集素等[8]。GPI型蛋白與β-1,6-葡聚糖側鏈連接,間接連接到β-1,3-葡聚糖骨架上,需經過β-葡聚糖酶的消化才可獲得。GPI型蛋白的錨定結構域在C端,靶蛋白的融合方式為N端融合。其中,由Aga1p和Aga2p組成的a-凝集素錨定系統比較特殊,Aga1p的C端具有GPI錨定結構與細胞壁共價結合,Aga2p與Aga1p通過二硫鍵連接,靶蛋白與Aga2p的C端或N端融合展示在酵母細胞表面。第三類錨定蛋白為內部重復蛋白(protein with internal repeats,PIR型蛋白),如Pir1p～Pir4p等。該類型蛋白與前2種錨定模式不同,其通過N端重復序列可以與細胞壁中的β-1,3-葡萄糖形成酯鍵連接,也可以利用C端半胱氨酸殘基通過二硫鍵附著在細胞壁的特定組分上,還可以同時利用2種錨定結構域進行插入型融合[9]。

圖2 常用錨定蛋白和錨定方式

2 酵母表面展示技術的應用研究進展

2.1 改善傳統發酵食品品質

2.1.1 在葡萄酒釀造領域的應用

葡萄酒的風味前體物質大多數以無氣味的糖苷形式存在,可被β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)等糖苷酶水解后釋放香氣。在葡萄酒釀造過程中添加以上商業酶制劑或固定化酶可以對增進葡萄酒的風味,但成本較高,且穩定性較差[10]。ZHANG等[11]將來源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-D-葡萄糖苷酶展示在釀酒酵母細胞表面,通過優化載體、啟動子、錨定蛋白以及轉錄融合伴侶等策略實現了β-D-葡萄糖苷酶的高效穩定展示。采用了3種錨定蛋白(Sag1p、Sed1p、Cwp2p)。其中Sag1p的錨定能力最強,全細胞酶活力最高達到(74.58±5.88) U/g。重組全細胞酶對香氣糖苷的水解能力是商業酶制劑AR2000的2.1倍。同時探索了葡萄酒發酵環境因素對全細胞酶活力的影響。

葡萄酒中的有機酸會顯著影響口感,蘋果酸和酒石酸占葡萄酒總酸的70%～90%,降低蘋果酸的含量十分必要[12]。釀酒酵母缺乏轉化蘋果酸的酶系,需由乳酸菌主導進行蘋果酸-乳酸發酵過程,將蘋果酸轉化為乳酸和二氧化碳[13]。ZHANG等[14]將來源于酒酒球菌(Oenococcusoeni)的蘋果酸乳酸酶(malolactic enzyme,MLE)在釀酒酵母細胞表面展示。錨定蛋白為α-凝集素的C端結構域。所構建的全細胞酶與蘋果酸反應12 h后,可將21.11%的蘋果酸轉化為乳酸,可用于在葡萄酒發酵過程中同時進行乙醇發酵和蘋果酸轉化過程。

過量的銅離子會導致葡萄酒氧化褐變,也會影響釀酒酵母的活性。目前主要解決銅過量的方法是添加“下膠劑”去除。黃蓉等[15]將內源金屬硫蛋白在釀酒酵母細胞表面展示,錨定蛋白選用C末端結合的絮凝蛋白Flo1p。構建的二倍體展示菌株重金屬耐受性得到提高,可以作為吸附葡萄酒中銅離子的全細胞催化劑。

白葡萄酒中的非穩定蛋白質會發生沉淀現象,會影響其風味和感官特性。黃蓉等[16]將來源于宇佐美曲霉(Aspergillususamii)的酸性蛋白酶展示在釀酒酵母細胞表面,選用Sed1p為錨定蛋白。分別構建了單倍體和二倍體的重組菌株,最高酶活力達到495.24 U/mL。可作為改善白葡萄酒介質低pH值條件下蛋白穩定性的全細胞催化劑。

2.1.2 在啤酒發酵領域的應用

在啤酒釀造過程中,異亮氨酸-纈氨酸途徑的中間體α-乙酰乳酸會被轉化成雙乙酰,當雙乙酰含量超過0.15 mg/L時,就會有類似餿飯的氣味,影響啤酒的風味。所以,雙乙酰含量高低成為衡量啤酒質量的重要標志之一。研究發現,在啤酒生產中添加α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate decarboxylase,ALDC)可以將α-乙酰乳酸分解成3-羥基-2-丁酮和二氧化碳,有效地降低雙乙酰含量,縮短釀造周期進而大幅降低生產成本[17]。然而,使用商業ALDC制劑將使該過程成本更高,且異源酶將留在啤酒中。CEJNAR等[18]選用α-凝集素的C末端結構域作為錨定蛋白,將有紋膜醋酸菌(Acetobeαcerαceti)的ALDC展示到釀酒酵母表面,構建了全細胞催化劑,能夠消除發酵麥芽汁中雙乙酰的積累,發酵7 d后,麥芽汁中幾乎不存在雙乙酰。

β-葡聚糖是啤酒發酵原料大麥和燕麥等的細胞壁主要成分之一。在釀造過程中,高濃度的β-葡聚糖會導致啤酒粘度高,形成凝膠狀沉淀,降低麥芽汁產量,影響啤酒的品質。啤酒中與β-葡聚糖相關的問題可以通過在麥芽生產、發酵中添加商用β-1,3-1,4-葡聚糖酶來緩解[19]。GUO等[20]構建了具有雙向啟動子的食品級表面展示系統,將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因與α-凝集素錨定基因融合,在半乳糖激酶1(GAL1)啟動子的調控下表達融合基因。磷酸甘油酸激酶1(PGK1)啟動子誘導α-半乳糖苷酶表達作為食品級選擇標記。在含有蜜二糖作為唯一碳源的培養基中,誘導32 h后重組菌株YGMPNA-PM的全細胞酶酶活力達到45.1 U/mL。與游離酶相比,重組全細胞酶的熱穩定性增強。這些結果表明,利用構建的食品級β-1,3-1,4-葡聚糖酶表面展示酵母重組菌株進行啤酒發酵具有改善啤酒釀造過程的潛力。

綜上,在葡萄酒和啤酒釀造領域,酵母表面展示系統的宿主細胞大多是釀造菌株釀酒酵母,展示載體選用食品級的篩選標記,靶蛋白是能夠提升酒品品質的關鍵功能酶,如增進風味的糖苷酶、提高酒品澄清度的沉淀分解酶等。單一功能的全細胞酶應用較為廣泛,應用時需要確定在釀造脅迫因子(高濃度糖、乙醇以及低pH值)存在下的全細胞酶穩定性。

2.2 簡化發酵生產過程

低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)一種優良的水溶性膳食纖維。已被用于治療人類遺傳性肥胖和單純性肥胖[21]。FOS的大規模生產涉及利用游離或固定化的果糖基轉移酶轉化蔗糖,副產物為葡萄糖、果糖和殘余蔗糖,方法昂貴且耗時。ZHANG等[22]將來源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的果糖基轉移酶展示在可產赤蘚糖醇的解脂亞羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)細胞表面,以PIR型細胞壁蛋白Pir1p作為錨定蛋白。全細胞酶轉化蔗糖制造低聚果糖的生產強度為160 g/(L·h),可重復使用10次以上。高濃度、低附加值的FOS副產物(葡萄糖和果糖)可同時被全細胞酶利用生產赤蘚糖醇,這種大規模生產FOS的高效方法極具應用價值。

低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)與人乳中的乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在結構和功能上具備一定的相似性[23],可以促進腸道有益細菌增殖、預防感染和提高免疫力等[24]。目前,工業上使用具有半乳糖基轉移酶活性的β-半乳糖苷酶以乳糖為原料生產GOS。通常是四階段的過程,即酶的生產、純化、固定化和轉化,既耗時又昂貴。因此,有必要開發易于操作的GOS生產工藝。在赤蘚糖醇發酵行業中,副產物廢棄酵母泥由于處理不當而引發嚴重的環境問題。AN等[25]將來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶展示到生產赤蘚糖醇的解脂亞羅維亞酵母細胞表面,錨定蛋白為Pir1p。將表面展示β-半乳糖苷酶的廢酵母泥作為全細胞催化劑以乳糖為原料二次發酵生產低聚半乳糖。在pH值為5.5和60 ℃條件下,以起始細胞濃度為5 g/L CDW時,6 h內將500 g/L乳糖轉化為160 g/L GOS,轉化率為51%,酵母泥可以循環使用10次以上。全細胞酶的最佳反應溫度比游離酶高約20 ℃,轉化效率遠高于游離酶,與其他方式的固定化酶效率相近。

低聚異麥芽糖(isomalto-oligosaccharides,IMOs)是聚合度為2～10的多聚葡萄糖混合物,是一種性質優良的益生元。由酶轉化的IMOs聚合度通常為2～4,包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖等[26]。目前工業上采用多酶協同法由淀粉經過液化(耐熱α-淀粉酶)→糖化(真菌α-淀粉酶或β-淀粉酶)→轉苷(α-葡萄糖苷酶)三步法合成低聚異麥芽糖,步驟繁瑣、成本較高。因此開發更加經濟簡便的方法生產IMOs具有重要的應用價值[27]。劉大文等[28]將來源于熱硫嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)的耐熱β-淀粉酶和來源于黑曲酶的耐熱α-葡萄糖轉苷酶進行順序連接,共同展示在解脂亞羅維亞酵母細胞表面,錨定蛋白選用Pir1p。50 ℃條件下,全細胞酶利用液化的淀粉可一步法轉化合成純度為75.3%的IMOs。錢玲等[29]將來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的麥芽三糖生成酶展示到畢赤酵母GS115細胞表面,錨定蛋白選用GPI型細胞壁蛋白Gcw61p。全細胞酶活力可達到260 U/g,且熱穩定性較好,重復利用3次后仍有80%的活性,可將30%麥芽糊精酶解為麥芽三糖,轉化率為60.13%。將展示麥芽三糖生成酶的全細胞酶加入到利用淀粉制備IMOs的糖化反應中,可為黑曲霉α-葡萄糖苷酶提供更多的麥芽三糖底物,有利于IMOs總產量的提高,且低聚異麥芽糖組分更加豐富。

異麥芽酮糖是蔗糖的一種結構異構體。作為替代蔗糖的替代品,異麥芽酮糖無毒性,是公認安全的甜味劑,具有較低的升糖指數,且不能被口腔中的致齲細菌利用,適合用于各種食品和飲料的添加。由于其化學合成的復雜性,酶生物轉化法是生產異麥芽酮糖的首選方法[30]。蔗糖異構酶(sucrose isomerase,EC 5.4.99.11)可將蔗糖生物轉化為異麥芽酮糖。LEE等[31]將來源于腸桿菌屬(Enterobactersp.)FMB-1菌株的蔗糖異構酶展示在釀酒酵母EBY100菌株的細胞表面,使用Aga2p作為錨定蛋白。與在大腸桿菌中表達的重組游離酶相比,展示的全細胞酶熱穩定性顯著增強。在不同底物濃度范圍(50～250 mmol/L)下,蔗糖轉化為異麥芽酮糖的轉化率為6.4%～7.4%。

海藻糖可以防止蛋白質或氨基酸產生美拉德反應,是最為常用的食品添加劑[32]。海藻糖合成酶可以通過從低成本底物麥芽糖一步轉化合成海藻糖[33]。LI等[34]將嗜熱古菌(Pictrophilustorridus)的海藻糖合酶基因展示到解脂亞羅維亞酵母細胞表面,錨定蛋白選用Pir1p。在最佳的發酵條件下,海藻糖的產率達到73%,與從重組大腸桿菌中純化的游離酶相比,展示的全細胞酶的熱穩定性和pH穩定性得到了改善。YANG等[35]將來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的海藻糖合成酶基因與錨定蛋白Pir1p融合展示在巴斯德畢赤酵母GS115細胞表面。在5 L發酵罐中發酵150 h,重組全細胞酶活力達到1 109 U/g,展示細胞以麥芽糖漿作為底物生產海藻糖轉化率超過60%,在循環使用3次后仍具有較高的催化活性。研究結果表明,采用全細胞催化劑一步法發酵麥芽糖生產海藻糖是經濟、有效的途徑,適合大規模的工業化生產。

綜上,利用微生物發酵和酶法工藝進行低聚糖的生產是該領域的發展趨勢。表面展示功能酶的全細胞催化劑在活性和穩定性方面顯著高于游離酶和固定化酶,可多次重復利用,在大規模的工業生產中具有較大的應用潛力。

2.3 生產高值和增值食品

長鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)對大腦和神經系統發育至關重要。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是功能脂肪酸中的主要活性成分。從魚油、海藻油和漁業副產品等含有PUFA的原料中富集DHA或EPA成為一個重要的研究領域。采用化學方法提取和濃縮PUFA對脂肪酸沒有選擇性,并且消耗大量能量[36]。利用脂肪酶(三酰甘油酰基水解酶,EC 3.1.1.3)催化的選擇性水解是生產PUFA濃縮物的一種簡單高效的方法。PAN等[37]將來源于地霉屬(Geotrichumsp.)的脂肪酶在巴斯德畢赤酵母細胞表面展示,錨定蛋白選用釀酒酵母的a-凝集素的N端結構域。在30 ℃下培養96 h后,全細胞酶水解橄欖油的活性達到(273±2.4) U/g。在選擇性水解的基礎上進行生物轉化富集,EPA和DHA從原始魚油中的1.53%和24.1%增加到1.85%和30.86%,分別增加了1.21和1.29倍。EPA和DHA的總收率達到46.62%。XU等[38]使用源自釀酒酵母的a-凝集素作為錨定蛋白,將皺紋假絲酵母脂肪酶展示在巴斯德畢赤酵母細胞表面。展示的全細胞酶與游離酶相比,熱穩定性更高,對橄欖油的水解活性最高達到(380±2.8) U/g。從海藻油中富集DHA,在最佳條件下發酵96 h后,DHA的含量從原始藻油中的40.61%提高到50.44%,產量增加了1.24倍。該研究是從海藻油中提取DHA的首次報道。

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)是一種具有改善記憶、預防阿爾茨海默癥、緩解抑郁和減少壓力的功能性食品添加劑。PS可以從動物器官、大豆、蛋黃、植物油等生物質中提取,但其獲得效率較低,限制了工業規模生產[39]。磷脂酶D(phospholipase D,EC.3.1.4.4)可以催化磷脂酰膽堿與L-絲氨酸的轉磷酰化反應制備PS,其催化具有反應條件溫和、環境友好、易于工業化生產等優點。LIU等[40]將來源于褐色鏈霉菌(Streptomyceschromofuscus)磷脂酶D基因pldsh進行密碼子優化后在巴斯德畢赤酵母GS115細胞表面進行過表達展示,錨定蛋白選用細胞壁蛋白Flo1p。與游離酶比,展示的全細胞酶的熱穩定性、酸穩定性和有機溶劑耐受性顯著增強。在最佳條件下使用水相體系,全細胞酶可將67.5%的磷脂酰膽堿轉化為PS,經過7次分批循環后,PS的轉化率仍保持在50%以上。LIU等[41]將來源于色粘鏈霉菌(Streptomyceshalstedii)的磷脂酶D與錨定蛋白Flo1p絮凝功能結構域融合表達,展示在巴斯德畢赤酵母GS115細胞表面,制備利用磷脂酰膽堿和L-絲氨酸合成PS的全細胞生物催化劑。全細胞酶在較寬的溫度(20～60 ℃)和pH值(4.0～8.0)范圍內穩定。在最佳工藝條件下,PS的轉化率為53%,全細胞酶在水相體系中催化4次后產率仍保持在40%以上。

表1 酵母表面展示技術在食品發酵領域的應用Table 1 Application of yeast surface display technology in food fermentation

木糖醇是一種由D-木糖衍生的甜味劑,廣泛應用于食品行業。以木質纖維素廢料生產木糖醇是一種可以顯著降低其生產成本的方法。GUIRIMAND等[42]將木糖還原酶(XR)、β-葡萄糖苷酶(BGL)、木糖苷酶(XYL)和木聚糖酶(XYN)等展示在釀酒酵母YPH499菌株表面。使用全細胞酶以稻草水解液直接生產木糖醇,發酵過程不需要添加任何商業酶。稻草水解液中所含的木糖中以79.5%的理論產率轉化為5.8 g/L的木糖醇。此外,稻草水解物發酵過程中同時進行納濾分離以去除其中的發酵抑制劑,促進了高濃度木糖醇的生產(37.9 g/L)。此項研究是酵母細胞表面技術和膜分離技術相結合生產木糖醇的首次報道,可進一步的擴展到工業應用中去。

綜上,酵母菌的底物利用范圍大、環境適應能力強。酵母全細胞催化劑能將可以利用的天然廉價底物轉化為高值產品。單獨催化元件的表面展示可能具有一定局限性,對全細胞催化劑進行多基因、多組分的網絡重構分析具有很好的工業應用前景。

3 結論與展望

酵母表面展示技術對于食品發酵工業產生了多方面的影響。在發酵產物方面,酵母表面展示技術可以通過重新設計傳統的發酵食品生產過程,從而生產新穎的產品或避免合成副產品提高產品品質。在發酵過程方面,酵母表面展示技術可以傳統的發酵食品生產方式,集成多步催化過程,構建“細胞工廠”提高資源轉化效率。在發酵原料方面,酵母表面展示技術可以擴大食品發酵的反應底物范圍,將廉價的原料轉化為更有價值的目標產品,可以實現可再生原料或低值原料的高值利用[43]。

然而,酵母表面展示技術在食品發酵領域的應用仍有許多問題需要解決。在宿主選擇方面,目前已廣泛應用的展示宿主僅為釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂亞羅維亞酵母等有限的種類。作為公認安全的乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、布拉氏酵母等其他酵母表面展示系統的建立已見報道,但仍未被進一步開發及利用,食品級宿主資源還需進一步挖掘。在靶蛋白選擇方面,選用展示單酶進行簡單催化反應的實際應用場景較多,從單酶到多酶共展示協同發酵技術是今后的研究和開發方向。在錨定蛋白選擇方面,選用單一錨定蛋白進行直接展示是一種比較簡潔方便的方法,有利于工業的生產。然而對于分子質量較大結構復雜難以直接展示的蛋白,可能需要通過間接展示的方式來實現[44]。深入研究酵母細胞結構,開發新的錨定方式將有利于酵母表面展示技術的發展。盡管存在問題,但是隨著酵母展示技術的不斷完善和改進,能科學地指導傳統發酵產業的升級,在食品領域發揮越來越重要的作用。