高溫大曲中真菌類群解析及其風(fēng)味品質(zhì)評價

王玉榮,高君,雷炎,管桂坤,劉宇,侯強川,郭壯*

1(湖北文理學(xué)院,湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽,441053) 3(山東蘭陵美酒股份有限公司,山東 蘭陵,277731)

作為醬香型白酒釀造過程中所必須的糖化發(fā)酵劑和生香劑,高溫大曲不僅為發(fā)酵體系提供了豐富的酶系和菌系,亦賦予了酒體豐富的風(fēng)味物質(zhì)及其他前體成分[1]。高溫大曲中風(fēng)味代謝物的形成需要經(jīng)過復(fù)雜的發(fā)酵過程,主要依賴于內(nèi)源酶和微生物之間的相互作用,其中微生物群落的組成和豐度顯著影響了大曲中風(fēng)味代謝物的形成[2]。SHI等[3]通過探究黑、白和黃3種高溫大曲的微生物群落和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),Thermomyces(嗜熱真菌屬)是所有大曲中共有的優(yōu)勢真菌屬,且Thermoascus(嗜熱子囊菌屬)和Aspergillus(曲霉屬)與大曲中絕大多數(shù)含量豐富的揮發(fā)性代謝物呈正相關(guān)。沈世明等[4]通過對高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)以及曲香風(fēng)味物質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn),Byssochlamys(絲衣霉菌屬)和Pichia(畢赤酵母屬)隨著貯存時間的延長逐漸變?yōu)榇笄械膬?yōu)勢真菌屬,且Pichia等酵母屬與酯類物質(zhì)存在正相關(guān)。由此表明,以霉菌和酵母菌為主的真菌群落結(jié)構(gòu)對大曲風(fēng)味品質(zhì)的形成具有不可忽視的作用[5],因此探究高溫大曲中真菌微生物群落及其與風(fēng)味代謝物之間的相關(guān)性是很有必要的。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基于免培養(yǎng)的高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing,HTS)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸深入,研究人員可以借助該技術(shù)對高溫大曲中大部分微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析[6]。JIANG等[7]通過揭示高溫大曲生產(chǎn)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律發(fā)現(xiàn),異常威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)為大曲生產(chǎn)初期的優(yōu)勢真菌屬,隨著大曲發(fā)酵溫度升高,Wickerhamomyces逐漸消失,扣囊覆膜酵母屬(Saccharomycopsis)和Thermoascus的豐度逐漸升高,大曲發(fā)酵結(jié)束期間,Thermomyces和Thermoascus成為大曲中的優(yōu)勢真菌屬。ZUO等[8]對2種制曲方式下高溫大曲的細菌組成進行研究發(fā)現(xiàn),機制大曲的細菌多樣性和Bacillus相對豐度均高于手工大曲。電子鼻技術(shù)具有操作簡單、客觀可靠且重現(xiàn)性良好的優(yōu)勢,可以有效反映樣品中特征揮發(fā)性物質(zhì)及其風(fēng)味品質(zhì)。CAI等[9]對不同類型低溫大曲風(fēng)味品質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn),紅心大曲中芳香類物質(zhì)豐度較高,清茬大曲和后火大曲的風(fēng)味較為相似。張春林[10]通過對瀘州老窖大曲進行分析表明,電子鼻分析可以有效區(qū)分高溫優(yōu)級大曲與中溫優(yōu)級大曲、中溫普級大曲和高溫普級大曲之間的氣味差異。綜上表明,高溫大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)受到發(fā)酵溫度、生產(chǎn)周期和制曲方式等多種因素的影響,因此,利用HTS和電子鼻聯(lián)用技術(shù)對高溫大曲中真菌類群與其風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性進行分析是可行的。

山東省臨沂市蘭陵縣地處我國白酒黃淮流域超級產(chǎn)區(qū),四季分明且雨熱同期,屬于溫帶季風(fēng)氣候,適合于大多數(shù)微生物的生長繁殖。本研究首先利用MiSeq高通量測序技術(shù)對蘭陵高溫大曲中真菌多樣性進行解析,再結(jié)合電子鼻對其風(fēng)味品質(zhì)進行評價,并進一步探究真菌屬與風(fēng)味品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性,以期為高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)及真菌類群的解析提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲樣品,采集自山東省臨沂市蘭陵縣某酒廠制曲車間;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA),青島海博生物技術(shù)有限公司;QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒,德國QIAGEN公司;引物ITS3F/ITS4R,武漢天一輝遠生物科技有限公司;5×TransStartTMFastPfu Buffer、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、2×PCR Buffer、rTaq酶、PMD 18-T載體,北京全式金生物技術(shù)有限公司;Axygen PCR清潔試劑盒,成都康迪生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-08A新型密封式粉碎機,北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司;霉菌培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國ProteinSimple公司;NanoDrop ND-2000C微量紫外-可見光分光光度計,美國Nano Drop公司;DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀,北京六一生物科技有限公司;vetiri96 ProFlex梯度基因擴增儀,美國Applied Biosystems公司;PE300型高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機架式服務(wù)器,美國DELL公司;PEN3電子鼻,德國AIRSENSE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集與預(yù)處理

本研究使用的高溫大曲由山東省臨沂市蘭陵縣某白酒釀造廠提供(117°41″～118°18″E,34°37′～35°06″N),共隨機采集了15份同一批次黃色高溫大曲樣品,依次編號為LL1～LL15。

1.3.2 高溫大曲中霉菌和酵母菌落計數(shù)

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》對高溫大曲中霉菌和酵母進行活菌計數(shù),即：稱取25 g大曲樣品,加入到225 mL無菌生理鹽水中進行倍比稀釋,準(zhǔn)確吸取1 mL適宜稀釋度的樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿中,采用傾注法注入適量的PDA固體培養(yǎng)基,并在28 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)5 d,每個梯度設(shè)置3個平行。

1.3.3 基于高通量測序技術(shù)解析大曲真菌多樣性

DNA提取：根據(jù)制造商的使用指南,利用QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒從2 g大曲樣品中提取總基因組DNA。DNA的提取質(zhì)量及濃度和純度分別通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外-可見光分光光度計進行檢測與分析[11],檢測合格的DNA樣品進行后續(xù)分析。

PCR擴增：使用引物ITS3F和ITS4R對真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)進行PCR擴增[12]。擴增體系：4 μL的5×PCR緩沖液,4 μL的dNTPs(2.5 mmol/L),0.8 μL的ITS3F(5 μmol/L),0.8 μL的ITS4R(5 μmol/L),0.4 μL的DNA聚合酶(5 U/μL),0.2 μL的BSA和10 ng的DNA模板,并用ddH2O補充至20 μL。擴增參數(shù)：95 ℃預(yù)加熱3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃復(fù)性45 s,循環(huán)35次;72 ℃保持10 min。PCR的擴增質(zhì)量通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[13],并利用Axygen PCR清潔試劑盒對檢測合格的PCR產(chǎn)物進行純化。

高通量測序：待測樣品寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,使用PE300型高通量測序平臺將擴增合格的PCR清潔產(chǎn)物進行測序。

1.3.4 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

使用QIIME平臺(v1.9.0)對樣品中真菌群落的擴增子序列進行分析。首先參考LI等[14]的方法對原始序列進行質(zhì)量控制,通過UCLUST兩步法將有效序列按照100%和97%相似度建立分類操作單元(operational taxonomic units,OTU)[15],使用UCHIME算法去除含嵌合體序列OTU[16],選取代表性序列與UNITE數(shù)據(jù)庫進行同源性比對并確定物種分類學(xué)地位[17],并基于真菌門和屬水平對微生物豐度進行統(tǒng)計,計算樣品中真菌群落α和β多樣性指數(shù)。

1.3.5 基于電子鼻技術(shù)分析大曲風(fēng)味品質(zhì)

取10 g待測大曲樣品于電子鼻頂空進樣瓶中,樣品體積約占樣品瓶的1/3,并用帶聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)硅膠墊片的頂空瓶蓋密封。每份樣品設(shè)置3個平行,并在室溫下平衡30 min后進行頂空進樣。進樣條件[18]：首先傳感器置于干燥空氣中平衡120 s,檢測時間90 s;樣品測試時間60 s,取樣間隔1 s,清洗時間110 s,歸零時間5 s;測量時間、預(yù)采樣時間和注射流量分別為90 s、5 s和300 mL/min。選取傳感器信號較為穩(wěn)定的49～51 s為信號采集時間,并將傳感器響應(yīng)值的平均值用于后續(xù)實驗分析。

1.3.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理及可視化分析主要在Excel 2016、Origin 2021、R4.1.0和GraphPad Prism 9中進行與實現(xiàn)。當(dāng)2組方差不均勻時,采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗法對2個聚類之間進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭陵地區(qū)高溫大曲中真菌類群OTU分布和β多樣性分析

采用MiSeq高通量測序技術(shù),本研究從15份蘭陵高溫大曲中共獲得923 724條序列,經(jīng)過質(zhì)量控制、去除嵌合體并按照97%相似度被劃分為6 778個OTU。若某一個OTU存在于15個高溫大曲中,則將其定義為核心OTU。本研究首先統(tǒng)計了高溫大曲中OTU的分布情況,并進行了基于加權(quán)UniFrac距離的層次聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),結(jié)果見圖1。

a-OTU花瓣圖;b-層次聚類分析圖1 高溫大曲真菌類群的OTU花瓣圖和基于加權(quán)UniFrac距離的層次聚類分析

由圖1-a可知,15份高溫大曲真菌類群共有12個核心OTU,包含793 381條序列,占有效序列的86.37%。除核心OTU外,不同高溫大曲中亦含有133～534個OTU,包含165～54 035條序列,占有效序列的0.02%～5.88%。由此可見,作為同一批次的高溫大曲,雖然共有大量核心真菌類群,但不同高溫大曲之間真菌群落結(jié)構(gòu)亦存在一定差異。由圖1-b可知,當(dāng)加權(quán)UniFrac距離為5時,除高溫大曲LL2、LL3、LL4、LL6、LL8和LL10外,其余9份高溫大曲明顯聚為一類。因此,本研究將高溫大曲LL1、LL5、LL7、LL9、LL11、LL12、LL13、LL14和LL15定義為聚類I,將高溫大曲LL2、LL3、LL4、LL6、LL8和LL10定義為聚類II。

2.2 蘭陵地區(qū)高溫大曲中霉菌和酵母菌落計數(shù)及真菌類群α多樣性分析

為了更直觀比較2個聚類中真菌類群結(jié)構(gòu)的差異,本研究采用純培養(yǎng)技術(shù)對2個聚類中可培養(yǎng)霉菌和酵母進行了菌落計數(shù)分析,并計算了2個聚類真菌類群發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù),發(fā)現(xiàn)物種數(shù)可以有效評估樣品中物種豐富度,香農(nóng)指數(shù)則用于評估物種多樣性[11]。結(jié)果如圖2所示。

a-霉菌和酵母菌落數(shù);b-發(fā)現(xiàn)物種數(shù);c-香農(nóng)指數(shù)圖2 兩個聚類中霉菌和酵母菌落數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)

由圖2可知,聚類I和聚類II的平均霉菌和酵母菌落數(shù)分別為6.37 lgCFU/g和5.82 lgCFU/g,平均發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為182和434,平均香農(nóng)指數(shù)分別為0.48和2.92。經(jīng)過Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn),2個聚類高溫大曲中霉菌和酵母菌落數(shù)差異不顯著(P>0.05),而發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)指數(shù)差異極顯著(P<0.001),表明隸屬于聚類I的高溫大曲真菌類群的豐富度和多樣性均顯著偏低。

2.3 蘭陵地區(qū)高溫大曲中真菌類群分析

為進一步探究2個聚類高溫大曲在真菌群落結(jié)構(gòu)上的差異,本研究選取代表性序列與數(shù)據(jù)庫進行同源性比對,共鑒定到4個真菌門和32個真菌屬,并對2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌門和屬進行了可視化統(tǒng)計分析。2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌門分布情況及差異分析見圖3。

由圖3可知,高溫大曲中真菌主要隸屬于2個門,分別為Ascomycota(子囊菌門)和Mucoromycota(毛霉門),其在聚類I和聚類II中的平均相對含量分別為99.83%和0.17%以及99.05%和0.94%。經(jīng)過Mann-Whitney檢驗表明,2個聚類中Ascomycota和Mucoromycota相對含量差異均不顯著(P>0.05)。2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌屬分布情況及差異分析見圖4。

由圖4可知,高溫大曲中真菌主要隸屬于4個屬,分別為隸屬于Ascomycota的Thermomyces、Aspergillus和Thermoascus以及隸屬于Mucoromycota的Thermomucor(嗜熱毛霉屬),其在聚類I和聚類II中的平均相對含量分別為96.44%、1.47%、1.34%和0.13%以及46.60%、37.89%、13.03%和0.93%。經(jīng)過Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn),較之聚類II,聚類I高溫大曲中Thermomyces相對含量極顯著偏高(P<0.001),而Aspergillus相對含量極顯著偏低(P<0.001)。由圖4-f可知,所有蘭陵高溫大曲中Thermomyces和Aspergillus相對含量呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)性(P<0.001)。

PANG等[19]對中國北方地區(qū)高溫大曲微生物類群進行分析發(fā)現(xiàn),Thermomyces、Thermoascus、Byssochlamys(絲衣霉屬)和Aspergillus是黑色、白色和黃色大曲中的優(yōu)勢真菌屬,且嗜熱菌Thermomyces和Thermoascus可以編碼與糖化和乙醇發(fā)酵相關(guān)的酶。鄧燦等[20]對湖北某酒廠高溫大曲真菌群落進行解析發(fā)現(xiàn),Thermomyces、Thermoascus和Aspergillus是構(gòu)成大曲微生物群落的3個真菌屬,且優(yōu)級曲中嗜熱菌Thermomyces和Thermoascus占比98.89%,Aspergillus僅占比0.57%,這與本研究中聚類I高溫大曲分析結(jié)果相似。通過文獻調(diào)研,ZHANG等[21]指出Thermomyces、Thermoascus和Aspergillus是高溫大曲中主要的真菌類群,這與本研究所得結(jié)論一致。

2.4 蘭陵地區(qū)高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)分析

PEN3電子鼻含有對特定揮發(fā)性氣體具有較高靈敏度的金屬傳感器,可以快速且客觀的對樣品進行檢測分析[22]。本研究基于電子鼻技術(shù)對大曲樣品的風(fēng)味品質(zhì)進行評價,電子鼻傳感器的響應(yīng)值與風(fēng)味物質(zhì)的濃度呈現(xiàn)正相關(guān),通過Mann-Whitney檢驗對兩個聚類的各傳感器響應(yīng)值進行了比較分析,結(jié)果見表1。

表1 兩個聚類高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)的比較分析(n=15)Table 1 Comparative analysis of flavor quality of two clusters of high-temperature Daqu (n=15)

由表1可知,傳感器W1C對聚類I高溫大曲的響應(yīng)值比聚類II高,而傳感器W1 W、W2S、W2 W和W3S對聚類I高溫大曲的響應(yīng)值比聚類II低,且除了傳感器W2 W的響應(yīng)值在2個聚類之間差異顯著(P<0.05)之外,其余6個傳感器的響應(yīng)值在2個聚類之間差異均不顯著(P>0.05)。由此表明,較之聚類II,聚類I高溫大曲中有機硫化物含量顯著偏低(P<0.05)。已有報道顯示,芳香類物質(zhì)是對白酒風(fēng)味貢獻最大的骨架風(fēng)味化合物之一[23],而大多數(shù)含硫化合物則具有令人不愉悅的氣味,如具有臭雞蛋味的硫化氫、具有豆腥味的二甲基三硫以及具有洋蔥味的二乙基硫、二甲基二硫和二乙基二硫等[24]。由此可見,聚類I高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)可能更佳,與上述真菌類群分析推測一致。

2.5 蘭陵地區(qū)高溫大曲真菌屬與風(fēng)味品質(zhì)的多元統(tǒng)計學(xué)分析

本研究基于主成分分析(principal components analysis,PCA)和普式分析(procrustes analysis),進一步對兩個聚類高溫大曲中平均相對含量>0.5%的真菌屬與風(fēng)味品質(zhì)評價指標(biāo)進行了空間排布和形狀映射,結(jié)果見圖5。

a-因子得分圖;b-因子載荷圖;b-普式分析圖5 基于高溫大曲真菌屬與風(fēng)味指標(biāo)的主成分分析和普式分析

由圖5-a可知,第一主成分包括Thermomyces、Aspergillus、W1C(對芳香類物質(zhì)靈敏)、W2S(對乙醇靈敏)、W2W(對有機硫化物靈敏)和W3S(對烷烴靈敏)共6個指標(biāo),第二主成分包括Thermoascus、Thermomucor、W3C(對氨氣、芳香類物質(zhì)靈敏)、W5C(對烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏)和W1W(對有機硫化物、萜類物質(zhì)靈敏)共5個指標(biāo),累計貢獻率為71.79%。此外,Thermomyces以及傳感器W1C、W3C和W5C敏感的物質(zhì)均分布于Y軸左側(cè),Thermoascus、Aspergillus和Thermomucor以及傳感器W2S、W3S、W1W和W2W敏感的物質(zhì)均分布于Y軸右側(cè)。由圖5-b可知,隸屬于聚類I的高溫大曲主要集中分布于Y軸左側(cè)和第四象限,隸屬于聚類II的高溫大曲則主要分布于Y軸右側(cè)和第三象限且空間排布分散。由此表明,隸屬于聚類I的高溫大曲Thermomyces豐度較高且芳香類物質(zhì)含量豐富,隸屬于聚類II的高溫大曲Thermoascus、Aspergillus和Thermomucor以及有機硫化物等物質(zhì)含量較高。

由圖5-c可知,通過對高溫大曲中菌群豐度和風(fēng)味強度的數(shù)據(jù)進行降維,納入本研究的樣品在一個低維空間內(nèi)產(chǎn)生了形狀映射,本研究在此基礎(chǔ)上進行了點坐標(biāo)之間偏差平方和(M2值)計算和顯著性檢驗(P值),結(jié)果表明高溫大曲中平均相對含量>0.5%的真菌屬與風(fēng)味因子之間具有非常顯著的相關(guān)性(P<0.01)。由此可知,高溫大曲在賦予發(fā)酵體系酶系和菌系的同時,對其風(fēng)味品質(zhì)亦產(chǎn)生了影響。基于Spearman相關(guān)性分析技術(shù),本研究進一步探究了真菌屬與風(fēng)味指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性,如圖6所示。

由圖6-a可知,Thermomyces與傳感器W2W的響應(yīng)值呈非常顯著負相關(guān)(P<0.01),Thermoascus與傳感器W2W的響應(yīng)值呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與傳感器W3C的響應(yīng)值呈顯著負相關(guān)(P<0.05),Thermomucor與傳感器W1W的響應(yīng)值呈非常顯著正相關(guān)(P<0.01),與傳感器WIC的響應(yīng)值呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。由此表明,高溫大曲中Thermomyces與有機硫化物存在顯著負相關(guān),而Thermoascus和Thermomucor與有機硫化物存在顯著正相關(guān),與芳香類物質(zhì)存在顯著負相關(guān)。由圖6-b和圖6-c可知,與高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)具有顯著相關(guān)性的真菌屬之間亦存在一定的關(guān)聯(lián)性,且Thermomyces和Thermoascus之間呈現(xiàn)顯著負相關(guān)(P<0.05)。綜合上述分析可知,隸屬于聚類I的高溫大曲Thermomyces和芳香類物質(zhì)含量豐富,且與Thermoascus和Thermomucor之間存在一定的負相關(guān)性,這表明Thermomyces對高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)形成可能具有積極貢獻。

3 結(jié)論

本研究將15份蘭陵地區(qū)高溫大曲劃分為兩個聚類,研究發(fā)現(xiàn),對兩個聚類高溫大曲的劃分具有重要影響的真菌類群主要為Thermomyces、Aspergillus、Thermoascus和Thermomucor。其中,Thermomyces相對含量豐富的聚類I高溫大曲中芳香類物質(zhì)含量明顯偏高,Aspergillus、Thermoascus和Thermomucor相對含量較高的聚類II高溫大曲中有機硫化物含量明顯偏高。由此可見,Thermomyces對高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)形成可能具有積極貢獻。