廣西道地藥材肉桂及陰香的DNA分子鑒定研究

李立,吳桂凡*,羅軼,李麗莉*,凌婕,馬雙成

1(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧,530021) 2(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京,100050)

中藥肉桂為樟科的植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)干燥樹(shù)皮,以“牡桂”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品。肉桂自古藥食同源,其性辛、甘、大熱。歸腎、脾、心、肝經(jīng),具補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈等作用[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明肉桂具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤的作用,對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病也有良好的療效[2-7]。2018年,中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將肉桂列入了《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)目錄》的征求意見(jiàn)稿中。2021年,廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局將肉桂確定為“桂十味”道地藥材品種。廣西作為肉桂藥材的道地產(chǎn)區(qū),其主產(chǎn)區(qū)主要在廣西防城港市、東興市、玉林市和貴港市等。肉桂作為藥食兩用中藥材,其相關(guān)產(chǎn)品涉及醫(yī)藥、食品、日用品、農(nóng)藥等多個(gè)領(lǐng)域,是國(guó)際上重要的藥用植物品種[8]。肉桂用量大、栽種時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格高、貨源緊缺,因此在廣西市場(chǎng)上常出現(xiàn)以肉桂同科植物陰香(Cinnamomumburmanni)冒充肉桂出售,其在外觀、性狀、顏色及氣味等方面特征都與肉桂相似,容易造成混用的現(xiàn)象[9-10]。目前鑒別肉桂和陰香主要是通過(guò)性狀、組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、理化性質(zhì)等傳統(tǒng)鑒別方法[11-14]。這些方法易受樣品形式、組織來(lái)源、貯存條件和人員操作等因素的影響,存在人為主觀因素強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差等弊端,尤其是當(dāng)肉桂和陰香經(jīng)研磨成粉后,傳統(tǒng)的鑒別方式很難將二者區(qū)別。因此需要建立一種高效、便捷、精確的區(qū)分肉桂和陰香的方法。

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)在中藥學(xué)領(lǐng)域的滲透與發(fā)展,基于DNA分子生物技術(shù)的分子鑒定方法稱為中藥4大鑒定方法(基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定)的重要補(bǔ)充,得到了不斷的發(fā)展與應(yīng)用。作為實(shí)用性強(qiáng)的分子生物技術(shù),不僅具有鑒定方法不受個(gè)體形態(tài)特征限制、不受個(gè)體發(fā)育階段影響,從基因水平上能客觀區(qū)分物種的優(yōu)勢(shì),還具有操作方法相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)提取不同產(chǎn)地的肉桂和陰香的基因組DNA,使用psbA-trnH引物擴(kuò)增后測(cè)序,通過(guò)查找兩者的psbA-trnH序列差異,設(shè)計(jì)并篩選出高特異性的鑒別引物,建立了可區(qū)別兩者的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系,為藥食同源物種肉桂的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的DNA分子標(biāo)記方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂藥材的道地產(chǎn)區(qū)在廣西,故本實(shí)驗(yàn)的樣品均采集于廣西區(qū)內(nèi),主要來(lái)自企業(yè)種植基地、普通農(nóng)戶自家田地散種以及野外采集。樣品經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所黃清泉主管藥師鑒定,硅膠干燥,陰干保存,存放于廣西食品藥品檢驗(yàn)所標(biāo)本室,樣品具體信息見(jiàn)表1。

表1 肉桂及其陰香的樣品采集信息表Table 1 Sample collection information table of Cinnamomum cassia and Cinnamomum burmanni

瓊脂糖,BIOWEST公司(批號(hào)：111885);GelRed,BIOTIUM公司(批號(hào)：41003);PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker,TAKARA公司(批號(hào)：AL52852A、AI5230SA);2X F8 LongFast PCR MasterMix,艾德萊公司(批號(hào)：331523AX);KOD OneTM PCR Master Mix,Toyobo公司(批號(hào)：041500);Platinu Ⅱ Hot-Start Green PCR Master Mix,ThermoFisher公司 (批號(hào)：01147162);Q5酶,NEW ENGLEND公司(批號(hào)：0161512);新型植物組織基因組DNA提取試劑盒,天根公司(批號(hào)：W0229);引物由華大基因合成,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000梯度PCR擴(kuò)增儀,美國(guó)Bio-Rad公司;TA96SG梯度PCR擴(kuò)增儀,德國(guó)耶拿公司;Mini-sub cell GT瓊脂糖凝膠電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司;Nano Value PLUS微量紫外分光光度計(jì),Cytiva公司;GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)BIO-RAD公司;ME203型電子天平,Mettler Toledo公司;MIKRO220R高速冷凍離心機(jī),Hettich公司;XW-80A漩渦振蕩儀,Kylin-Bell Lab Instruments公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

取適量樣品用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇擦拭表面,晾干,用球磨儀研磨成粉末。取約20 mg,采用天根新型植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品的DNA,然后使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度,合格的DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

利用植物藥DNA條形碼通用引物psbA-trnH序列對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為20 μL,其中2X F8 LongFast PCR MasterMix 10.0 μL,psbA-trnH上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1.0 μL,滅菌蒸餾水8.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,運(yùn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增所得產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.3psbA-trnH序列分析

將測(cè)得的序列去除測(cè)序低質(zhì)量數(shù)據(jù),使用BioEdit軟件對(duì)正向及反向序列進(jìn)行拼接。使用MEGA 6.0軟件對(duì)肉桂及其陰香的拼接序列進(jìn)行對(duì)比分析,尋找可供特異性引物設(shè)計(jì)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)。通過(guò)圖1的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),肉桂和陰香基本上是不連續(xù)的單堿基差異,在第34個(gè)堿基至第35個(gè)堿基處,肉桂為AA,陰香為GT;在第37個(gè)堿基至第38個(gè)堿基處,肉桂為AG,陰香為CT;在第40個(gè)堿基至第41個(gè)堿基處,肉桂為AC,陰香為TT。

圖1 肉桂及陰香的psbA-trnH序列比對(duì)

1.3.4 特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)肉桂及陰香在葉綠體psbA-trnH基因序列中發(fā)現(xiàn)的特異性位點(diǎn),使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5分別設(shè)計(jì)肉桂及陰香的特異性引物。引物序列信息見(jiàn)表2。

表2 特異性引物信息表Table 2 Specific primers information table

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)條件的篩選與優(yōu)化

2.1.1 退火溫度考察

使用艾德萊2X F8 LongFast PCR MasterMix酶,按PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,退火溫度分別考察了50、52、54、56、58、60 ℃。經(jīng)試驗(yàn),如圖2所示,當(dāng)退火溫度由50 ℃升高至60 ℃后,肉桂和陰香經(jīng)肉桂引物擴(kuò)增后,只有在54 ℃時(shí)肉桂在100～200 bp出現(xiàn)單一擴(kuò)增條帶,而陰香沒(méi)有擴(kuò)增條帶,其他溫度下擴(kuò)增陰香均有干擾;因此選擇54 ℃作為肉桂引物擴(kuò)增時(shí)的最佳退火溫度。另外,2個(gè)品種經(jīng)陰香引物擴(kuò)增后,在56 ℃時(shí)陰香在200～300 bp有明顯的單一擴(kuò)增條帶, 而肉桂沒(méi)有擴(kuò)增條帶,當(dāng)溫度進(jìn)一步升高,條帶亮度減弱,因此陰香引物擴(kuò)增時(shí)的最優(yōu)退火溫度為56 ℃。

M-D1000 DNA Marker;1-空白對(duì)照;2、4、6、8、10、12-陰香藥材;3、5、7、9、11、13-肉桂藥材A-肉桂引物退火溫度考察;B-陰香引物退火溫度考察圖2 不同退火溫度條件下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 反應(yīng)循環(huán)數(shù)考察

如圖3和圖4所示,肉桂引物在35個(gè)循環(huán)的時(shí)候得到明顯亮度的單一條帶,陰香引物在40個(gè)循環(huán)出現(xiàn)明顯亮度的單一條帶,最終確定肉桂引物的循環(huán)數(shù)為35,陰香引物的循環(huán)數(shù)為40。

M-D1000 DNA Marker;11-空白對(duì)照;2、4、6、8、10-陰香藥材;1、3、5、7、9-肉桂藥材圖3 肉桂引物不同循環(huán)次數(shù)條件下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 DNA模板量的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了1、2、5、10、20、40 ng的DNA模板量,結(jié)果顯示(圖5、圖6),肉桂引物在加入模板量為5 ng時(shí)有隱約可見(jiàn)的條帶,加入量為20 ng時(shí)條帶亮度明顯;陰香引物在模板加入量為20 ng時(shí)才出現(xiàn)條帶,40 ng時(shí)條帶亮度明顯。

M-D1000 DNA Marker;1～5-1、2、5、10、20 ng;6-空白對(duì)照?qǐng)D5 肉桂引物不同模板量下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

M-D1000 DNA Marker;1～6-40、20、10、5、2、1 ng;7-空白對(duì)照?qǐng)D6 陰香引物不同模板量下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.1.4 摻偽檢出限的考察

制備陰香質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、10%、20%、50%的肉桂和陰香混合粉末樣品,提取基因組DNA后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示(圖7),陰香質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%以上時(shí)出現(xiàn)陰香特異性條帶,說(shuō)明混合樣品中陰香檢出限為10%。

2.2 耐受性考察

2.2.1 引物酶的種類考察

本實(shí)驗(yàn)采用2X F8 LongFast PCR MasterMix(艾德萊)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TAKARA)、KOD OneTMPCR Master Mix(Toyobo)等不同品牌的酶對(duì)鑒別反應(yīng)結(jié)果影響的檢測(cè)。結(jié)果表明(圖8、圖9),3種聚合酶都可擴(kuò)增出肉桂和陰香的特異性條帶,可鑒別出肉桂和陰香。陰香引物用KOD OneTM PCR Master Mix(Toyobo)牌子的酶擴(kuò)增出的條帶特別亮,可考慮用該引物酶進(jìn)行擴(kuò)增。

M-D1000 DNA Marker;1、5、9-空白對(duì)照;2、6、10-陰香藥材;3、7、11-肉桂藥材;4、8-空泳道圖8 肉桂引物不同引物酶條件下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

M-D1000 DNA Marker;1、5、9-空白對(duì)照;2、6、10-肉桂藥材;3、7、11-陰香藥材;4、8-空泳道圖9 陰香引物不同引物酶條件下凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 PCR儀器品牌考察

本實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)ABI veriti梯度PCR擴(kuò)增儀和德國(guó)耶拿TA96SG梯度PCR擴(kuò)增儀對(duì)建立的PCR體系的耐受性進(jìn)行考察,結(jié)果均能得到很好的擴(kuò)增效果(圖10),說(shuō)明所建立的PCR鑒別體系耐受性良好。

2.2.3 適用性及專屬性考察

利用優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件,對(duì)所有采集到的肉桂及陰香進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示(圖11、圖12),肉桂經(jīng)肉桂引物擴(kuò)增后在100～200 bp處出現(xiàn)特異性條帶,陰香經(jīng)陰香引物擴(kuò)增后在200～300 bp處出現(xiàn)特異性條帶,表明本方法具有良好的特異性,能達(dá)到對(duì)2個(gè)品種進(jìn)行鑒別。

M-D1000 DNA Marker;1、14-空白對(duì)照;2～13-肉桂藥材;15～21-陰香藥材A-肉桂藥材PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果;B-陰香藥材PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖11 肉桂及陰香藥材凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(肉桂引物)

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肉桂及其近似物種進(jìn)行研究。楊培等[15]通過(guò)葉綠體psbA-trnH條形碼序列對(duì)肉桂及其近似品種的物種內(nèi)及物種間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究,成功構(gòu)建了鑒別肉桂及其近似品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。但利用DNA條形碼鑒別的弊端在于每次都需要對(duì)分析樣品進(jìn)行測(cè)序分析,且相近類群?jiǎn)挝稽c(diǎn)的DNA條形碼缺乏足夠變化,所以不能準(zhǔn)確鑒別所有種。DOH等[16]比較了來(lái)自越南、中國(guó)、日本的肉桂、錫蘭肉桂和香樟等的DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列,可用于肉桂皮、桂枝、煙仔桂植物基原的鑒定,但未能對(duì)肉桂和陰香的植物基原進(jìn)行鑒定。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用植物組織基因組DNA提取試劑盒提取,提取的DNA濃度高,純度佳,保證了DNA模板的質(zhì)量。引物設(shè)計(jì)是整個(gè)研究的關(guān)鍵點(diǎn),直接關(guān)系到目標(biāo)物種是否能夠成功檢出。本實(shí)驗(yàn)選取肉桂和陰香的psbA-trnH基因序列作為靶基因,利用MEGA 6.0軟件對(duì)其基因序列進(jìn)行序列同源性比較分析,尋找特異性SNP位點(diǎn),利用Primer Premier 5分別設(shè)計(jì)肉桂及陰香的特異性引物,并通過(guò)考察退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)、引物酶等獲得各自最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系。結(jié)果顯示,肉桂經(jīng)肉桂引物擴(kuò)增后在100～200 bp處出現(xiàn)特異性條帶,陰香無(wú)條帶;陰香經(jīng)陰香引物擴(kuò)增后在200～300 bp處出現(xiàn)特異性條帶,肉桂無(wú)條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅可在普通的瓊脂糖凝膠上分辨,還避免了因香辛料加工過(guò)程中DNA降解導(dǎo)致的擴(kuò)增效率降低,提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

與其他分子標(biāo)記方法相比,SNP方法因其簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)已在中藥材的真?zhèn)舞b別中有應(yīng)用[17-23]。本研究利用了基于SNP位點(diǎn)建立的PCR體系實(shí)現(xiàn)了肉桂和陰香的鑒別,在檢測(cè)樣品時(shí)無(wú)需再對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序,可以在較短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品的快速鑒別,具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),為保障肉桂的藥材質(zhì)量,肉桂初加工及深加工產(chǎn)品的植物來(lái)源提供了有力的技術(shù)支持。