低濃度微酸性電解水對純培養及海蝦中副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的殺滅作用

劉陽,王程可苡,楊宇,羅宗洪,常冠紅,王新,張春玲

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院,陜西 楊凌,712100)

生活水平的提高和膳食結構的轉變,使得人們更加傾向于將肉類食品作為蛋白質攝入源。海產品作為一種優質的蛋白質來源,對于大眾營養和健康必不可少。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是導致海產源食物中毒的最主要致病菌,它可引起海水養殖動物間弧菌病的流行和暴發性死亡,誤食該菌感染的海產品易引發胃腸炎和敗血癥等疾病[1]。副溶血性弧菌常與海產品中的特定腐敗菌-腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)共存于近岸海水和海產品中。腐敗希瓦氏菌能還原海產動物肌肉中的氧化三甲胺并產生H2S氣體,同時能夠降解蛋白質等營養成分,造成海產品營養物質的破壞和風味品質的劣變。副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的污染已造成嚴峻的食品安全問題和極大的經濟耗損[2-3],因此尋找一種高效的方法來減少或消除食品中的食源性致病菌和腐敗菌對食品安全和人類健康至關重要。

常用化學類殺菌劑雙氧水、臭氧、季氨化合物等在食品加工中的使用會導致化學殘留和環境污染問題。常用物理方法有超高壓殺菌、輻照殺菌等,但由于滅菌成本高,應用限制多,不適合大規模使用。微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water, SAEW)作為一種廣譜型的非熱殺菌技術,是通過電解稀鹽酸和/或氯化鈉溶液產生的具有特殊理化性質的水溶液。SAEW已被證明對多種病原體具有較強的殺菌作用[4-5]。SAEW具有高效廣譜的殺菌效果及綠色環保的優點,被認為是食品工業中使用的化學消毒劑的有效替代品,已被應用于水果、蔬菜和肉類等食品中病原菌的殺滅和控制,延長產品貨架期,并能保持原有的色澤、風味及質構[6-8]。

雖然已證明SAEW在食品行業應用的有效性,但是作為含氯殺菌劑,其在食品中的使用濃度受到嚴格的監管。GB 28234—2020《酸性電解水生成器衛生要求》規定在食品生產加工中SAEW可使用的有效氯濃度(available chlorine concentration, ACC)為40～80 mg/L。另外,含氯消毒劑清洗有機農產品和肉類食品后,水中殘留的ACC規定不得超過4 mg/L[9]。因此,低濃度微酸性電解水(low concentration slightly acidic electrolyzed water, LcSAEW)可能是最適合應用于食品消毒的選擇。已證明LcSAEW(0～10 mg/L)對單核細胞增生性李斯特菌[10]、大腸桿菌O157∶H7[11]有較好的殺滅效果,但該技術對海蝦中優勢致病菌-副溶血性弧菌和優勢腐敗菌-腐敗希瓦氏菌的殺滅效果以及作用機制尚未探究。本研究對LcSAEW處理純培養及海蝦中副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果進行對比,并通過生長曲線、內容物滲漏、電導率、膜電位、活性氧(reactive oxygen species, ROS)的測定以及細胞超微結構的觀察,探究對兩種細菌的滅活機理,為進一步研究LcSAEW殺菌機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌CHPC 1.1833由上海海洋大學藍蔚青教授贈送,副溶血性弧菌ATCC 17802由本實驗室保存;ATP試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、活性氧檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;DiBAC4(3),北京索萊寶科技有限公司;LIVE/DEAD BacLight細菌細胞活性測定試劑盒,賽默飛世爾科技有限公司;中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis),購買于陜西楊凌海鮮市場,每只約20 g。

1.2 儀器與設備

Harmony-Ⅱ型微酸性電解水生成器,北京睿安德有限公司;PTH 027型余氯測量計,英國百達靈有限公司;FE28-Standard型pH/ORP儀,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Bioscreen C型微生物生長曲線儀,芬蘭Oy Growth Curves Ab公司;Spark型酶標儀,上海帝肯貿易有限公司;AZ86031型水質檢測儀,中國臺灣衡欣科技股份有限公司;PinAAciie 900F型火焰原子吸收光譜儀,美國Perkin Elmer公司;Nano SEM-450型掃描電子顯微鏡,美國FEI公司;Leica TCS SP8 X型激光共聚焦顯微鏡,德國Leica公司;UV2550型紫外可見分光光度計,日本島津儀器有限公司;DH-11L型拍打式均質器,寧波洛尚智能科技有限公司。

表1 不同有效氯濃度的低濃度微酸性電解水對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的滅活效果Table 1 Inactivation effect of slightly acidic electrolyzed water with different available chlorine concentrations onV.parahaemolyticus and S.putrefaciens

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液與LcSAEW的制備

將副溶血性弧菌(或腐敗希瓦氏菌)凍存液劃線到3% NaCl TSA(或LB)平板上獲得單菌落,挑取單菌落于3% NaCl TSB(或LB)肉湯中37 ℃(或25 ℃)振蕩培養18 h。用0.85%的生理鹽水洗滌(5 000×g,10 min,4 ℃)并調整菌懸液濃度至108CFU/mL。同時,通過電解水發生器電解0.1% NaCl和0.01% HCl溶液制備后稀釋得到低濃度微酸性電解水(LcSAEW),立即測定其ACC、pH值與氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)值。

1.3.2 LcSAEW對純培養菌懸液的處理

將1 mL菌懸液加入到9 mL不同濃度的LcSAEW中,處理30 s后用0.5% Na2S2O3中和劑終止殺菌。然后用生理鹽水進行梯度稀釋, 從適宜梯度中取0.1 mL涂布于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂平板或鐵瓊脂平板進行細菌計數。無菌去離子水處理作為空白對照。

1.3.3 蝦樣品的接種及LcSAEW對接種蝦的處理

參照WANG等[12]方法,將蝦沸水浴20 min,滅活蝦體內的原生細菌。待蝦冷卻到室溫(25±2) ℃,將1 mL不同菌懸液分別滴加于蝦的背部和腹部,靜置附著20 min。接種濃度約為7 lgCFU/g。接種后,將蝦放入180 mL LcSAEW(ACC=10 mg/L)中,分別浸泡0.5、1、3、5、10 min。處理結束后,將蝦轉移至中和劑中均質2 min,如1.3.2節所述進行細菌計數。未處理的接種蝦作為對照組。

1.3.4 微生物生長曲線

將不同處理后的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌菌懸液按照10%接種量添加于3% NaCl TSB和LB肉湯中,培養溫度分別設置為37 ℃和25 ℃,用微生物生長曲線分析儀每隔1 h測定1次OD600nm值,總運行時長為24 h。每組3個平行。以培養時間為橫坐標,OD600nm為縱坐標,繪制微生物生長曲線。

1.3.5 膜電位測定

細菌膜電位的測定參照FADHEL等[13]方法。在不同處理后的菌懸液中加入1 μmol/L熒光染料DIBAC4(3),黑暗中孵育20 min,使用多功能酶標儀檢測熒光強度,激發/發射波長為492/515 nm。

1.3.6 電導率的變化

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,收集上清液,然后使用水質檢測儀測定其電導率。

1.3.7 細菌胞內物質滲漏量測定

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,收集上清液。使用紫外可見分光光度計測定OD260nm表示DNA含量。蛋白質含量采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定。K+濃度使用火焰原子吸收光譜儀測定766.5 nm處的吸光度。

1.3.8 細胞內ROS水平測定

ROS檢測試劑盒測定細胞內ROS水平。在LcSAEW處理前,先將細菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,將細胞懸浮于10 mmol/L DCFH-DA溶液,37 ℃孵育20 min。再用無菌生理鹽水清洗,去除多余的DCFH-DA。

1.3.9 細菌內ATP含量測定

將不同處理后的菌懸液在12 000 r/min條件下離心3 min,棄上清液,加裂解液破碎細菌,離心取上清液,按照ATP檢測試劑盒說明測定ATP濃度。

1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察

將不同處理后的菌懸液于8 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液。所得沉淀用2.5%的戊二醛溶液懸浮后固定10 h,用無菌生理鹽水洗滌3次后,分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水后重懸,取適量樣品滴至導電硅片上,CO2臨界點干燥后固定噴金,在掃描電鏡下觀察菌體形態。

1.3.11 激光共聚焦顯微鏡觀察

將不同處理后的菌懸液于8 000 r/min條件下離心5 min,棄上清液后懸浮至無菌生理鹽水中。向每1 mL細菌懸液中加入3 μL SYTO 9/PI的2X染料,在黑暗中孵育15 min。滴加5 μL在載玻片上,使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光并拍照分析。SYTO 9和PI染料的激發/發射波長分別為485/540 nm和535/610 nm。

1.4 統計分析

所有實驗均為3次重復,結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析,采用Duncan′s法進行顯著性分析,差異顯著水平P<0.05;采用Origin 2022軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 LcSAEW對純培養副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

不同ACC的LcSAEW的理化性質及對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅情況如表1所示。相比于對照組,ACC為0.5、1、2 mg/L的SAEW處理后,副溶血性弧菌分別減少了1.93、4.03、5.29 lg CFU/mL,而腐敗希瓦氏菌分別減少了0.59、1.17、2.8 lg CFU/mL。當ACC為4、8 mg/L時,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌相繼被殺滅至未檢出水平,可知LcSAEW對副溶血性弧菌的殺菌效果更顯著。并且隨著ACC增加,兩種菌的細菌數量均顯著下降(P<0.05),說明ACC是影響殺菌效果的主要因素。與先前的報道結果一致,ACC越高,LcSAEW對大腸桿菌[11]、沙門氏菌[14]以及銅綠假單胞菌[15]的殺菌活性也越強。

2.2 LcSAEW處理對蝦表面接種菌的殺菌效果

LcSAEW(ACC=10 mg/L)對接種了副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的海蝦進行不同時間(0.5、1、3、5、10 min)的處理,結果如圖1所示。與對照組相比,殺菌效果隨著處理時間的延長而顯著增強(P<0.05)。當處理時間為10 min時,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的微生物數量分別下降了1.6、1.25 lg CFU/g。LcSAEW殺滅含有機物質的食品基質中的微生物時,LcSAEW中的有效作用成分在有機物質作用下會產生損耗[16],故海蝦表面接種菌與純培養細菌殺滅效果差異較大。

圖1 低濃度微酸性電解水處理對蝦表面接種的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的殺滅效果

2.3 LcSAEW處理對細菌生長的影響

通過測定生長曲線進一步評估了LcSAEW對2種菌的抑制作用,結果如圖2所示。在對照組(ACC=0 mg/L)中,副溶血性弧菌(圖2-A)與腐敗希瓦氏菌(圖2-B)都經過2 h遲緩期后迅速進入對數生長期,隨后在13 h和14 h達到穩定期。隨著ACC的增加,兩種菌的遲緩期都明顯延長,并且最終細菌濃度(OD600nm)都相應降低。值得注意的是,在ACC為10 mg/L時腐敗希瓦氏菌被完全抑制生長,而ACC為6 mg/L時即可徹底殺滅副溶血性弧菌,與平板計數結果一致。LI等[10]報道ACC為12 mg/L的LcSAEW可在30 s內完全殺滅單核細胞增多性李斯特菌,說明不同的細菌對ACC敏感性存在一定差異。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖2 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌生長的影響

2.4 LcSAEW處理對細胞內容物的影響

2.4.1 DNA和蛋白質的泄漏

細胞內物質泄漏的測定是細胞膜完整性損傷的重要評價指標[17-18]。如圖3所示,與對照組相比,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌經LcSAEW處理后細胞外DNA水平顯著升高(P<0.05),且呈濃度依賴關系。而細胞外蛋白水平雖然呈增加趨勢,但只有副溶血性弧菌在ACC為10 mg/L時顯著高于對照組(P<0.05)。當LcSAEW作用于細菌時,釋放到細胞外的蛋白質和DNA大分子,可作為膜損傷的主要特征物質[17]。蛋白質與DNA泄露的變化趨勢一致,進一步驗證了LcSAEW對細胞膜完整性的破壞。

A-蛋白質;B-DNA圖3 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的胞內蛋白質和DNA滲漏的影響

2.4.2 細胞內K+的滲漏

K+是細菌內最豐富的陽離子,參與基本的生命活動,并調節細胞的滲透壓和氧化還原電位[19]。鉀通道的激活和鉀離子的泄漏與超極化現象密切相關,K+的泄漏已被用來監測抗菌劑造成的細菌膜破壞[20]。如圖4所示,除了腐敗希瓦氏菌在ACC為1、2 mg/L時,經LcSAEW處理后2種細菌的上清液中K+濃度(與對照組對比)都具有顯著性差異(P<0.05),與膜電位檢測結果完全吻合。細胞內K+的損失會造成多種代謝途徑受阻,破壞細胞滲透壓的調節和內環境穩定。

圖4 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內K+滲漏的影響

2.5 LcSAEW處理對細菌膜電位和電導率的影響

膜電位指質子通量引起的電化學梯度在細胞膜上產生的電位差[21],是合成ATP的驅動力之一。本研究用探針DiBAC4(3)檢測LcSAEW對副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的膜電位的影響。如圖5-A所示,ACC為6、10 mg/L的LcSAEW處理后2種細菌的膜電位(與對照組對比)都存在顯著性差異(P<0.05)。LcSAEW使2種細菌的膜電位降低,導致細胞膜超極化,且呈ACC依賴性。LIU等[22]報道了SAEW可引起腐敗希瓦氏菌和腐生葡萄球菌的超極化現象,與本研究結論一致。膜電位發生超極化可能是由于LcSAEW處理導致了細胞膜上離子通道的失活和破壞[23],部分帶電離子跨膜運輸,使膜內外電位差增大,極化狀態加強[24]。

A-膜電位;B-電導率圖5 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的膜電位和電導率的影響

細菌電導率的變化可以反映其細胞膜通透性的改變,其改變常伴隨著胞內小分子物質如離子、磷酸鹽等電解質的流出[25]。如圖5-B所示,經LcSAEW處理后,隨著濃度的增加,副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的電導率相應升高,且與對照組對比都具有顯著性差異(P<0.05)。根據膜電位、電導率和胞外K+含量等通透性實驗結果,都說明細菌膜內外出現離子紊亂,標志著細胞膜通透性的增強,導致細胞功能異常。

2.6 LcSAEW處理后細胞內ROS和ATP水平的變化

ROS是細胞代謝的副產物,過量累積會導致細胞內生物大分子的氧化損傷,從而破壞細菌結構和功能。如圖6-A所示,隨著ACC的增加,2種細菌胞內ROS的含量都逐漸增加。尤其是當ACC為6和10 mg/L時,ROS水平顯著高于對照組(P<0.05)。有研究報道,SAEW有效地抑制了單增李斯特菌[10]和假單胞菌[26]的抗氧化酶系統的活性。因此,本研究中LcSAEW可能破壞了菌體的抗氧化防御系統,導致了ROS的大量產生和積累,從而誘導細胞膜上多不飽和脂肪酸的過氧化[27]以及蛋白質羰基化。而上述2.4.1節中,細胞外蛋白水平沒有明顯變化,可能是蛋白質很快會與細菌內ROS[28]或LcSAEW中氯物質發生反應。

A-ROS;B-ATP圖6 低濃度微酸性電解水處理對副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內ROS和ATP的影響

ATP是微生物可利用能量的基本載體。ATP含量的降低會影響菌體的生命活動,抑制其生長和分裂[29]。本研究中ATP的測定采用生物發光法。如圖6-B所示,與對照組相比,LcSAEW可顯著降低細胞內ATP濃度(P<0.05),且具有ACC濃度依賴性。細菌內ATP的迅速耗盡,可能是因為LcSAEW攻擊細胞膜導致ATP的泄漏;膜電位(質子梯度)的消耗引起ATP的合成受阻[27];以及細胞內ATP酶的持續水解[30]。

2.7 LcSAEW處理對細菌超微結構的影響

2.7.1 細胞形態變化

為了證實LcSAEW引起的細菌損傷,采用掃描電子顯微鏡觀察處理后的菌體形態(圖7)。對照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌,均表現出典型的革蘭氏陰性桿菌的結構,表面規則光滑。經LcSAEW處理的副溶血性弧菌(圖7-A)表面出現明顯的凹陷及褶皺,且隨著LcSAEW濃度的升高,菌體嚴重皺縮甚至形成不規則小孔,導致內容物泄漏。而腐敗希瓦氏菌(圖7-B)經LcSAEW處理后表面結構無明顯坍塌,僅在質量濃度≥2 mg/L時出現凹陷和皺縮。結果表明,LcSAEW對2種細菌都具有一定的損傷作用,破壞程度呈濃度依賴性。并且在相同濃度下,副溶血性弧菌較腐敗希瓦氏菌表現出更顯著的結構變化。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖7 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的SEM圖像

2.7.2 細胞質膜完整性

使用混合熒光染料Syto 9和PI進行菌體染色,檢測經LcSAEW處理后細胞質膜的通透性變化(圖8)。低分子質量(～10 Da)綠色熒光染料Syto 9可以穿透完整和受損的細胞質膜,而高分子質量(～668 Da)紅色熒光染料PI只能穿透受損的細胞質膜[31]。對照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌均顯示Syto 9染料的綠色熒光,說明細胞膜是完整的。而經LcSAEW處理的細菌出現黃色或紅色熒光,且隨著LcSAEW濃度的升高,2種熒光比例增加,表明質膜完整性受損。并且在相同濃度下,副溶血性弧菌的黃色或紅色熒光比例明顯高于腐敗希瓦氏菌,表明LcSAEW對副溶血性弧菌細胞質膜完整性的破壞更強。

A-副溶血性弧菌;B-腐敗希瓦氏菌圖8 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的CLSM圖像

3 結論

本研究以海蝦中優勢致病菌-副溶血性弧菌和優勢腐敗菌-腐敗希瓦氏菌為研究對象,探究了LcSAEW對純培養及海蝦表面接種菌的殺菌效果以及作用機制。結果表明,LcSAEW對2種菌均具有較強的殺滅作用,殺菌效果呈ACC依賴性;并且隨著處理時間的增長,LcSAEW對蝦表面接種菌的殺滅效果也增強。LcSAEW殺滅副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌可能的機制包括：a) LcSAEW破壞細胞膜完整性,導致膜通透性增加,造成DNA、蛋白質、ATP、K+等內容物的泄漏,激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察結果證實了LcSAEW對細胞外部結構的破壞作用;b) LcSAEW造成細胞膜超極化現象,細菌膜電位的改變干擾細胞正常的代謝活動,從而導致細菌死亡。部分離子通道激活導致K+等電解質的泄露正是造成細胞膜超極化的原因之一,而電導率的增加證明了膜內外的離子紊亂;c) LcSAEW造成ATP的快速耗盡,抑制細胞的生命活動;d) LcSAEW導致了ROS的大量產生和積累,造成細胞中生物大分子(蛋白質和DNA)的氧化損傷,以及細胞膜上多不飽和脂肪酸和膜蛋白的過氧化,從而破壞細菌細胞膜的結構和功能。