基于高效液相色譜（HPLC）的微生物發酵過程中的關鍵代謝物分析

吳世芳

青島職業技術學院生物與化工學院，山東 青島 266555

微生物發酵作為重要的生物技術，在工業生產和科學研究領域占據核心地位。從制藥到食品工業，微生物在發酵過程中產生的代謝物質對最終產品的質量和特性具有決定性影響。了解和監測這些關鍵代謝物的種類和濃度，是優化發酵過程、提高產品質量和產量的基礎。在此背景下，高效液相色譜（HPLC）技術作為一種強大的分析工具，能夠提供一種精確、高效的方法來分析和量化這些代謝物。HPLC 技術因其高分辨率、高靈敏度和良好的定量性能，在生物樣品分析中得到了廣泛應用。相關人員應用HPLC 技術可以精準識別和測定微生物發酵過程中產生的各種代謝物，包括酸類、醇類、氨基酸和多肽等。這些代謝物不僅揭示了微生物的生長和代謝狀態，而且也是優化發酵工藝和提升產品質量的關鍵指標[1]。本文基于高效液相色譜（HPLC）對微生物發酵過程中的關鍵代謝物展開分析，以期為工業生產和科學研究提供有價值的參考。

1 高效液相色譜(HPLC)技術概述

1.1 HPLC 的基本原理

高效液相色譜（HPLC）是一種強大的分析技術，是基于分子在固定相（色譜柱內部的固體材料）和流動相（通過色譜柱流動的液體）之間的分配或吸附差異來實現分離的[2]。在HPLC 中，樣品首先會溶解在流動相中，然后被注入色譜系統，流動相攜帶樣品通過色譜柱時，不同組分會根據其對固定相的親和力及其在固定相和流動相之間相互作用的差異，在色譜柱中以不同的速率前進，從而實現分離。

固定相是色譜柱的核心，通常由微小顆粒組成，如硅膠或其他聚合物材料等。這些顆粒的表面可以根據目標分析物的特性加以改性，例如，對于疏水性分子的分離，常使用疏水性的固定相材料；反之，對于極性分子，則采用更具親水性的固定相。流動相的選擇也是分析過程中的關鍵，其組成成分（包括溶劑類型和比例、pH 和離子強度）會直接影響樣品組分的溶解度和遷移速度。在樣品通過色譜柱后，不同組分會依次從色譜柱出口流出，并進入檢測器進行檢測。HPLC 中常用的檢測器有紫外—可見光譜檢測器、熒光檢測器和質譜檢測器等。這些檢測器可以提供關于樣品組分的定量和定性信息，如濃度、化學結構和相對分子質量等。通過調整色譜條件（如流動相的組成、色譜柱的類型和溫度、流速等），HPLC 能適應不同樣品的需求，實現高效、精確的分析。

1.2 HPLC 在生物樣品分析中的優勢與挑戰

在生物樣品分析領域，高效液相色譜（HPLC）展現了顯著優勢。首先，HPLC 技術的高分辨率使其能有效地分離出生物樣品中的復雜混合物，如蛋白質、核酸、小分子代謝物和生物堿等。這對于生物樣品中普遍存在的大量類似化合物的鑒定和定量至關重要。其次，HPLC 技術的多樣化檢測器選項（如紫外—可見光譜檢測器、熒光檢測器和質譜檢測器等）提供了多種定量和定性分析的方法，增強了其應用的廣泛性和靈活性[3]。上述這些優勢使HPLC 成為了生物醫學研究、藥物開發、臨床診斷和食品安全檢測等多個領域的重要工具。然而，HPLC 在生物樣品分析中也面臨諸多挑戰。首先，生物樣品的復雜性往往要求更高級別的樣品準備工作，如蛋白質的去除、復雜樣品的前處理和富集等，增加了分析的時間和難度。其次，生物樣品中的目標分析物常常穩定性差且易受環境影響。這就要求在整個HPLC 分析過程中采取特殊的操作條件和注意事項，以確保樣品的完整性和分析結果的準確性。

2 微生物發酵過程及關鍵代謝物

2.1 微生物發酵過程的概述

微生物發酵是一個涉及多種微生物，如細菌、酵母和霉菌等，通過代謝轉化有機物產生能量的生物化學過程。在發酵過程中，微生物在缺氧或厭氧條件下，通過代謝途徑分解有機底物，產生能量、代謝中間體和一系列次級代謝產物。該過程分為幾個關鍵階段，分別為底物的吸收和運輸、代謝途徑的活化、能量的產生和代謝產物的積累。在吸收階段，微生物通過細胞膜將底物轉運到細胞內部。在代謝途徑中，如糖酵解途徑或三羧酸循環途徑等，底物被進一步分解，產生能量、還原當量和一系列代謝中間體。這些中間體不僅是細胞生長和維持正常生理功能的基礎，也是許多重要工業產品，如抗生素、酶和生物燃料的前體。

控制和優化微生物發酵過程是工業生物技術中的核心。通過調節發酵條件，如溫度、pH、氧氣供應和底物質量濃度，可以影響微生物的生長速率和代謝產物的產量。此外，通過基因工程和代謝工程技術，可以改造微生物的代謝途徑，提高特定代謝產物的產量，生產新型生物化合物。

2.2 發酵過程中的關鍵代謝物種類

微生物發酵過程中產生的關鍵代謝物種類多樣，它們不僅是微生物生長和維持生理功能的必需物質，而且也是許多工業應用的重要產物。一方面，包括乙醇、乳酸、丁酸和醋酸等最基本的代謝物通常為能量代謝的直接產物，在許多類型的發酵過程中都能找到。例如，乙醇是酵母在厭氧條件下發酵糖類時的主要產物，被廣泛應用于釀酒和生物燃料生產[4]。乳酸是乳酸菌發酵過程的主要產物，主要應用于食品工業和生物材料制造。另一方面，除了這些基本代謝產物，微生物發酵還能產生一系列次級代謝物，如抗生素、維生素、酶和色素等。這些次級代謝物通常在微生物生長后期產生，對微生物自身而言非必需產物，但在人類醫藥和工業領域具有極高的應用價值。

2.3 代謝物在發酵過程中的作用

在微生物發酵過程中，代謝物不僅涉及能量產生和細胞生長，還會對環境適應性和發酵效率產生直接影響。一方面，初級代謝物是能量轉換和細胞生命活動的基礎，它們支持細胞的生長、繁殖以及對環境變化的快速響應。另一方面，次級代謝物雖然不直接參與基本的生命過程，但卻在微生物適應環境和生物合成特定有機物方面發揮著關鍵作用。例如，產生的某些抗生素和生物活性分子可以幫助微生物在競爭激烈的環境中生存，同時也為醫藥和食品工業提供了重要的原料。因此，理解和調控發酵過程中的代謝物，對于優化產物產量、提高工業生產效率以及開發新的生物工藝具有重要意義。

3 實驗分析

3.1 實驗設計與方法

本實驗旨在分析特定微生物發酵過程中的關鍵代謝物。實驗選取了酵母菌株作為微生物模型。為了培養酵母菌，準備含有葡萄糖的基礎營養培養基，確保足夠的碳源供發酵過程使用。培養過程在恒溫搖床上進行，溫度控制在30 ℃左右，pH 維持在5.0～5.5，以模擬最佳發酵條件。

實驗分為幾個關鍵階段，分別為接種、培養、取樣和分析。首先，在無菌條件下將酵母菌接種到培養基中，然后在搖床上進行培養。發酵過程中定期取樣，以監控關鍵代謝物的濃度變化。取樣后，通過對樣品進行離心處理，去除細胞和其他懸浮物。隨后，上清液用于HPLC 分析，以定量主要代謝物，如乙醇、甘油和有機酸等。HPLC 分析前的樣品準備包括過濾和適當稀釋，以適應色譜柱和檢測器的要求。根據目標代謝物的化學性質，選擇合適的色譜柱和流動相。通過這一系列嚴格的實驗步驟和方法，本實驗旨在全面評估特定酵母菌株發酵過程中代謝物的動態變化，為理解微生物發酵機制和優化發酵工藝提供科學依據。

3.2 發酵過程中代謝物的變化分析

為了詳細分析發酵過程中的代謝物變化，對酵母菌株在不同發酵階段（接種后12 h、24 h、48 h 和72 h）的代謝物進行了測定。關鍵代謝物包括乙醇、甘油、乳酸和有機酸等，代謝物濃度的對比分析如表1 所示。

表1 代謝物濃度的對比分析 單位：mg/L

隨著發酵時間的增加，乙質量醇濃度顯著上升，反映了酵母菌對糖類的代謝活動；甘油和乳酸的質量濃度也隨時間流逝而輕微上升，表明了這些代謝物在發酵過程中的副產物角色；有機酸質量濃度的增加則與酵母菌的次級代謝有關。這些數據的變化趨勢表明了酵母菌在發酵過程中的代謝狀態。乙醇質量濃度顯著增加體現了糖類的有效轉化，而甘油和乳酸的產生則與厭氧條件下代謝途徑的調整有關，有機酸的產生則與細胞生理狀態的變化和環境應激有關。

3.3 結果討論與意義

實驗利用高效液相色譜（HPLC）技術，分析了微生物發酵過程中的關鍵代謝物，結果顯示出明顯的代謝物變化趨勢。特別是乙醇質量濃度的顯著增加，不僅證明了酵母菌在糖類代謝過程中的效率，而且也凸顯了HPLC 在精確測量和監控發酵過程中代謝產物方面的能力。此外，甘油和乳酸的逐漸積累為理解微生物在不同環境壓力下的生理響應提供了有價值的信息。這些發現對于優化工業發酵過程，具有實際的應用價值。

4 結論

本文基于高效液相色譜（HPLC）技術，分析了微生物發酵過程中的關鍵代謝物，展現了該技術在微生物代謝分析領域的高效性和準確性。實驗結果顯示，乙醇、甘油、乳酸和有機酸等代謝物在發酵過程中發生了明顯的質量濃度變化，為理解酵母菌在不同發酵階段的代謝狀態提供了參考。這些發現不僅揭示了微生物代謝過程的復雜性，也為優化工業發酵過程提供了重要的科學依據。總之，HPLC 作為一種強大的分析工具，在未來的微生物發酵和生物工程研究中將繼續發揮關鍵作用。