微波輔助頂空固相微萃取GC-MS法分析檸檬草中揮發(fā)性成分

楊玉賢，張 瓊，楊紹坤，高云濤，和順琴*

(1.云南醫(yī)藥健康職業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650033；2.云南民族大學(xué)，云南 昆明 650500)

檸檬草(CymbopogoncitratusDC.Stapf)，學(xué)名香茅，亦名檸檬香茅，具有檸檬香氣，為草本香料[1]，可作為傳統(tǒng)調(diào)味品使用，也可入藥[2-4]，其標(biāo)志性成分有橙花醛、香葉醛、檸檬烯、香茅醛及香葉醇等[5]。主要在東半球熱帶及亞熱帶地區(qū)被廣泛種植[6]，在中國，主要生長在兩廣、福建、海南、臺灣等地區(qū)[7-8]。檸檬草性溫，味辛、甘，具有祛風(fēng)通絡(luò)、溫中止痛、止瀉的功效，也可用于治療風(fēng)寒濕痹、脘腹冷痛、泄瀉、跌打損傷以及由感冒引起的頭身疼痛等，其揮發(fā)性成分還具有安神、鎮(zhèn)靜、助眠的功效[9-11]。

揮發(fā)性成分的分析在香料風(fēng)味特性[12]、天然產(chǎn)物化學(xué)的研究[13]以及生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、食品質(zhì)量控制、傳統(tǒng)中醫(yī)藥研究[14]以及工業(yè)過程等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[12，15]。微波輔助萃取(MAE)則利用微波對含有植物原料的萃取溶劑進(jìn)行加熱，是近年來采用的一種從植物中提取揮發(fā)性組分的有效方法之一[16]。微波頂空固相微萃取是將微波同頂空固相微萃取技術(shù)相結(jié)合，可顯著改善其效率，逸出更多的揮發(fā)性成分。目前，有關(guān)檸檬草化學(xué)成分研究報道中多采用氣相色譜法、液相色譜法和原子吸收法等，這些方法均為檸檬草的質(zhì)量評價提供了較好的參考。但其采用前處理方法，如超臨界CO2萃取法、水蒸氣蒸餾法和超聲溶劑萃取法等均存在過程復(fù)雜、受基質(zhì)影響損失較大等問題[17-18]，可通過研發(fā)操作更簡單更經(jīng)濟的的聚焦微波反應(yīng)器來改善。本文設(shè)計出一種新的，簡單易制作、小型高效的微型底聚焦微波頂空固相微萃取(MA-HS-SPME)裝置，利用樣品自身所含水分吸收微波，無需添加溶劑，即可達(dá)到提取揮發(fā)性成分的目的，將其有效應(yīng)用于提取檸檬草樣品及其他植物揮發(fā)性成分的研究。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及儀器設(shè)備

材料：SHF臥式鋁制軸承座、鋁管、N母頭帶法蘭盤聚能輻射、微帶螺旋天線、四氟墊片、箔片。檸檬草樣品產(chǎn)自廣西東興地區(qū)，購于東南亞特色美食坊寶食品店，將購買的新鮮檸檬草樣品的葉片及根莖部分清洗干凈，葉片切成小段，根莖分別從橫、縱截面切開、風(fēng)干，取準(zhǔn)備好的葉片和根莖放入粉碎機中分別研磨至60目以下，備用。

試劑：蒸餾水。

儀器設(shè)備：STA449 F3型同步熱分析儀(德國耐馳儀器有限公司)；ISQ120839 THERMOFISHER(ISO)氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司)；57328-U 50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取SPME纖維頭(美國Supelco公司)；多功能粉碎機(旭朗，WN-300型)；20 mL 鉗口頂空瓶；微型底聚焦微波反應(yīng)器(實驗室自制)。

1.2 微型底聚焦微波反應(yīng)器

本文基于傳統(tǒng)微波諧振腔的研究和近場微波原理，并針對新型微波前處理體系研究需要，放棄已有的磁控管-波導(dǎo)-諧振腔饋能的傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)，由0～100 W 小功率的半導(dǎo)體固態(tài)微波源和微型的腔體組成，利用N型接頭連接內(nèi)導(dǎo)體和外導(dǎo)體，導(dǎo)體包括內(nèi)、外導(dǎo)體以及介質(zhì)；腔體包括軸承座、樣品腔和反射腔，通過SHF臥式鋁制軸承座將反射腔連接起來，再用氧化鋁合金架將軸承座和反射連接組成上部的樣品腔，用聯(lián)華高溫透明玻璃橢球底頂空瓶作為反應(yīng)器以及螺旋式上升微帶螺旋天線，研制出一種可用于頂空微萃取的固態(tài)微波源-同軸輸出-天線饋能的微型底聚焦微波反應(yīng)器。其由半導(dǎo)體固態(tài)微波功率源和微腔體溫和可控微波反應(yīng)裝置兩部分組成，同時還設(shè)計了專用的控制軟件系統(tǒng)，微波功率源控制器設(shè)有控溫模塊，通過功率與時間的控制，可較準(zhǔn)確控制反應(yīng)過程中的溫度，以及進(jìn)行連續(xù)式或每秒上百萬次的脈沖微波饋能，克服了諧振式反應(yīng)器的諸多不足，具有微波單模腔能量功率高、升溫穩(wěn)定可控的特點。而與已有側(cè)面聚焦微波系統(tǒng)對比，則反應(yīng)效率更高、體積小巧、可進(jìn)行微小量樣品的處理、易于實現(xiàn)批量化處理，其可通過微波輻射天線從反應(yīng)器底面將微波能定向饋入底部樣品，避免了微波能消耗加熱溶劑，利于對過程進(jìn)行更精準(zhǔn)的控制，并可與后續(xù)GC、HPLC、GC-MS等色譜進(jìn)樣系統(tǒng)匹配，方便與微萃取、酶解和衍生過程集成，明顯提高處理速度和反應(yīng)效率，故可將該底聚焦微波反應(yīng)器應(yīng)用于檸檬草等實際樣品的微波頂空分析，該裝置如圖1所示。

圖1 底聚焦微波反應(yīng)器結(jié)構(gòu)

1.3 方法

1.3.1 底聚焦微波反應(yīng)器性能驗證測試

1)微波泄露檢測

本文研制的微型底聚焦微波反應(yīng)器，用于檸檬草樣品粉末的升溫操作，并用微波輻射檢測儀檢測微波泄露。

2)紅外熱成像分析

準(zhǔn)確稱取檸檬草樣品粉末 0.50 g 于 10 mL 聯(lián)華高溫透明玻璃橢球底頂空瓶中，鉗緊頂空瓶蓋進(jìn)行密封，分別用常規(guī)加熱(水浴、油浴或金屬浴)和固定其它條件，微波功率為 20 W，微波條件下處理2 min的方式，用TESTO 865紅外線熱成像儀測定反應(yīng)體系的熱場溫度，記錄底部樣品溫度的變化并進(jìn)行分析。

3)升溫速率測定

準(zhǔn)確稱取檸檬草樣品粉末 0.50 g 于 10 mL 聯(lián)華高溫透明玻璃橢球底頂空瓶中，鉗緊頂空瓶蓋進(jìn)行密封，固定其它條件，微波條件(微波時間：1、2、3、4 、5 min；微波功率：10、20、30、40、50 W處理，用TESTO 865紅外線熱成像儀測定反應(yīng)體系的熱場溫度，記錄底部樣品溫度的變化并進(jìn)行分析。

4)溫差體系分析

按照前邊論述的3)的微波條件，固定其它條件，用TESTO 865紅外線熱成像儀測定反應(yīng)體系的熱場溫度，記錄底部樣品與頂空瓶頂部溫度的變化并進(jìn)行計算和分析。

1.3.2 頂空固相微萃取

采用固相微萃取SPME纖維頭和SPME纖維組件支架共同組裝而成的固相微萃取裝置，稱取檸檬草粉末樣品 0.5 g，30 W 條件下萃取 15 min，按照文獻(xiàn)[18]頂空測試微萃取方法進(jìn)行操作，進(jìn)行后續(xù)GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS 分析

色譜條件：色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度：220 ℃，檢測器溫度：220 ℃；柱初溫 45 ℃，保持 3 min，以 10 ℃/min 升到 90 ℃ 持續(xù) 2 min；以 6 min 升到 200 ℃，保持 5 min；高純氦氣(純度φ>99.999%)；載氣流速 1.0 mL/min；分流比∶10∶1；解析時間∶3 min，保留時間 3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)離子源；傳輸線溫度 280 ℃；離子源溫度 260 ℃；電子能量 70 eV；質(zhì)量掃描范圍 30～500m/z。

1.3.4 揮發(fā)性成分的分析

檸檬草樣品中各揮發(fā)性成分通過質(zhì)譜工作站Xcalibur 3.0對色譜峰進(jìn)行定性和半定量分析。通過計算機檢索，由儀器所配置的NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索匹配分析，將相似度(SI與RSI值均大于800)的組分先進(jìn)行選擇，再結(jié)合保留時間及參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，按峰面積歸一化法計算，對GC-MS檢測結(jié)果進(jìn)行鑒定，確定相應(yīng)化合物的名稱和各揮發(fā)成分在萃取物中的相對含量。見式(1)。

(1)

式中：A1為單組分揮發(fā)性風(fēng)味成分的峰面積；A2為揮發(fā)性風(fēng)味成分總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波泄露測定

微波泄露用微波輻射檢測儀檢測，此裝置的微波輻射泄露為 0.03 mW/cm2(明顯小于微波對人體健康產(chǎn)生危害的我國標(biāo)準(zhǔn)：1.00 mW/cm2和國際標(biāo)準(zhǔn)：5.00 mW/cm2)，如圖2所示。

(a)實物圖 (b)紅外圖

2.2 紅外熱成像分析

傳統(tǒng)上，已有的從外部熱源(如水浴、油浴或金屬浴)進(jìn)行常規(guī)加熱方式(圖3a，3b)，其不僅需要較大的腔體結(jié)構(gòu)，而且通常采用較大功率的微波能以保證足夠功率密度，溫度極難控制，極易在樣品區(qū)域形成過熱，使頂空瓶底面與頂部之間難以形成較大的溫度差區(qū)域，是一種低能量且緩慢的傳遞方式。而微型底聚焦微波是將樣品置于底面聚焦微波腔中，放棄傳統(tǒng)微波反應(yīng)器的諧振腔結(jié)構(gòu)，使用波導(dǎo)直接將微波能從反應(yīng)容器底面定向饋入樣品，通過聚焦腔向待處理樣品饋入微波能量(圖3c)，與傳統(tǒng)的加熱方式有很大不同，結(jié)果如圖3所示。

(a)家用微波爐(700 W, 3 min) (b)金屬浴(50 ℃, 30 min) (c)微腔體微波(20 W, 2 min)

2.3 升溫曲線分析

升溫速率測試表明，不同微波功率隨時間的升溫曲線在所研制的微型底聚焦微波反應(yīng)器內(nèi)，系統(tǒng)能量密度高、饋能均勻，在短時間內(nèi)只需10～50 W 的小功率微波就有較快的升溫速率，可達(dá)到較高溫度，微波聚焦饋能效率較高。微波功率與微波時間之間對應(yīng)形成的溫度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系趨勢，利于溫度的準(zhǔn)確調(diào)節(jié)控制，如圖4所示。

圖4 微波功率與微波時間對應(yīng)形成的升溫曲線

2.4 溫差曲線分析

在任何頂空SPME采樣的溫度分布中，通常都有一個上升段和一個下降段，它們之間存在一個最佳溫度[21-22]。微型底聚焦微波反應(yīng)器恰好可使樣品與萃取區(qū)形成兩個區(qū)域，在短時間內(nèi)使底部樣品達(dá)到一定溫度，使纖維涂層和樣品基質(zhì)之間形成顯著的溫度差。微波功率和處理時間與體系溫度增加呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，不僅隨著微波時間的不斷增加，溫度逐漸出現(xiàn)平緩的趨勢，而且明顯可以看出不同微波功率與微波時間相對應(yīng)的溫度與隨時間產(chǎn)生的上下溫度差曲線呈現(xiàn)正比的趨勢，可通過調(diào)節(jié)功率來調(diào)節(jié)溫度變化。上下溫度間隙的形成增強了樣品基質(zhì)中揮發(fā)性成分的釋放以及在頂空中的擴散和對流，對于揮發(fā)性成分而言，增加了纖維涂層上的捕獲能力，使提取萃取率提高，增加可控性，有效保護(hù)了固相微萃取纖維頭，這使反應(yīng)過程中的副產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率減少以及對于準(zhǔn)確性的控制具有重要意義，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同微波功率與微波時間相對應(yīng)的上下溫差升溫曲線

2.5 GC-MS分析

本文利用微型底聚焦微波反應(yīng)裝置與固相微萃取裝置，結(jié)合微波頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS)分析研究了檸檬草揮發(fā)性成分，如圖6：a和b分別是葉片和根莖經(jīng)微波處理，c和d分別是葉片和根莖經(jīng)金屬浴處理后頂空固相微萃取萃取物的GC-MS總離子流圖。 葉片和根莖中各類揮發(fā)性成分的種類和相對含量按1.3.4揮發(fā)性成分的分析進(jìn)行統(tǒng)計匯總，如表1所示。

(a)葉片,微波處理 (b)根莖,微波處理

(c)葉片, 金屬浴處理 (d)根莖, 金屬浴處理

表1 檸檬草葉片和根莖萃取物中的揮發(fā)性成分

表1(續(xù))

從表1可以看出，經(jīng)微波處理，從檸檬草葉片和根莖中分別鑒定出37種、46種揮發(fā)性成分；經(jīng)金屬浴處理，從葉片和根莖中分別鑒定出29種、42種揮發(fā)性成分。主要成分的組成差別不大，均以醛類、醇類和烯烴類物質(zhì)為主。其中，微波條件處理下葉片(89.93%)和根莖(77.29%)的萃取物揮發(fā)總量均優(yōu)于金屬浴條件處理下葉片(81.48%)和根莖(63.62%)的揮發(fā)總量。在微波和金屬浴條件處理下的葉片和根莖中含量較高的揮發(fā)性成分都是橙花醛和香葉醛，且微波條件處理獲得葉片中的主要揮發(fā)性成分橙花醛(29.27%)和香葉醛(22.14%)的相對含量要明顯優(yōu)于金屬浴條件下根莖中橙花醛(8.61%)和香葉醛(7.76%)的相對含量。檸檬草精油有較好的抑菌活性，其中的香葉醛和橙花醛已被證實為檸檬草精油中的抗菌活性成分[23-25]。而本研究提取的檸檬草葉片和根莖中橙花醛和香葉醛的含量分別高達(dá) 51.41%和16.37%。這為檸檬草精油的提取以及在抑菌方面的開發(fā)利用提供了很好的理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究通過采用自制微型底聚焦微波輔助無溶劑萃取裝置提取檸檬草樣品的揮發(fā)性成分，解決了已有方法中應(yīng)用對象是富含水分的新鮮樣品或者干燥樣品需經(jīng)過潤濕等耗時的前處理問題，更加適用于從干燥的樣品中提取揮發(fā)性成分。同時使用GC-MS法對檸檬草葉片和根莖萃取物中揮發(fā)性成分進(jìn)行直接快速分離分析鑒定，實驗結(jié)果表明檸檬草中的揮發(fā)性成分均以醛類、醇類和烯烴類物質(zhì)為主，而不同部位的揮發(fā)成分存在一定差異性，同時檸檬草葉片中橙花醛和香葉醛的含量要高于其根莖中的含量，這為檸檬草精油的提取以及在抑菌方面的開發(fā)利用提供了很好的理論依據(jù)。本方法可適用于植物樣品特別是固體樣品的直接快速分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。但本研究建立的微波輔助頂空固相微萃取GC-MS法僅是一種分離分析方法，難以收集獲得揮發(fā)油，因此本方法適用于樣品中揮發(fā)性組分的分離分析，不適于揮發(fā)油的制備。