HPLC測定甲磺酸二氫麥角堿緩釋片有關(guān)物質(zhì)

張發(fā)成，張 丹，管 嵐，萬竹青，蔣雪琴

(1.寶利化(南京)制藥有限公司，江蘇 南京 210038；2.南通大學(xué)，江蘇 南通 226001)

甲磺酸二氫麥角堿 (1)是天然麥角生物堿的四種雙氫衍生物的混合物，其組分包括甲磺酸二氫麥角考寧、甲磺酸二氫麥角汀和甲磺酸二氫-α-麥角隱亭、甲磺酸二氫β-麥角隱亭。依舒佳林 (1緩釋片)是1、卡波姆934P等經(jīng)制粒壓片而成，臨床上用于治療腦血管病后遺癥和老年病人的輕度血管性癡呆等[1]，具有臨床效果顯著、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)色譜柱使用壽命較短，且發(fā)現(xiàn)加速試驗(yàn)中的樣品有關(guān)物質(zhì)和含量數(shù)據(jù)物料不平衡。經(jīng)檢索文獻(xiàn)[2-3]發(fā)現(xiàn)，色譜柱壽命短，可能系卡波姆特性所致。因此，有必要研究新的樣品前處理及有關(guān)物質(zhì)檢測方法，以改善這一不足。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters e2695-2489，色譜工作站Empower3，電子天平Mettler Toledo XSE105DU (0.001 mg)，pH計(jì)Sartorius PB-10，超聲儀深圳歌能GS-100A，高速離心機(jī)赫西儀器 TG16MW。

試驗(yàn)樣品，寶利化(南京)制藥有限公司，批號(hào)2110003、2106002、2009001、2004001。

甲醇為TEDIA HPLC級(jí)，批號(hào)21095154；鹽酸為分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)為210306345H；磷酸氫二銨為分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)為151019975E；氯化鈉為分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)為201212699F；氯化鈣為分析純，國藥集團(tuán)，批號(hào)：20191127。

2 試驗(yàn)過程與結(jié)果

2.1 方法確定

按高效液相色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0512)的方法測定。取本品，研細(xì)，稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于甲磺酸二氫麥角堿 5 mg)，置 25 mL 量瓶中，加入2%的氯化鈉溶液 15 mL，搖勻，靜置 2 h，超聲處理 5 min，加乙腈稀釋至刻度。搖勻，離心(10000 r/min，5 min)，取上清液經(jīng)孔徑為 0.45 μm 的濾膜(材質(zhì)PTFE)過濾，棄去 2 mL 初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液 1 mL，置 50 mL 量瓶，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(2%)。稱取丁基羥基苯甲醚約 8 mg，置 25 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液；移取 1 mL 儲(chǔ)備液至 100 mL 量瓶中，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為丁基羥基苯甲醚溶液。精密量取對照溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用水-乙腈(體積比3∶2)稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液(0.2%)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Phenomenex Gemini C18柱，φ4.6 mm×250 mm，5 μm 或效能相當(dāng)?shù)纳V柱)；以甲醇作為流動(dòng)相A，0.005 moL/L 磷酸氫二銨(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5±0.2)為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫；檢測波長為 280 nm，進(jìn)樣體積為 25 μL。

表1 洗脫梯度表

精密量取靈敏度溶液 25 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，主峰2的信噪比應(yīng)不小于10。取對照溶液和供試品溶液各 25 μL 依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中主峰之間分離度應(yīng)符合要求，如有雜質(zhì)峰，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度應(yīng)符合要求，扣除輔料峰后，各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液色譜峰面積之和(2%)，小于靈敏度溶液(0.2%)主峰1峰面積的峰忽略不計(jì)。

2.2 前處理方法的開發(fā)

經(jīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)[3]發(fā)現(xiàn)，卡波姆在pH 6～12時(shí)可形成水凝膠的結(jié)構(gòu)，較為粘稠；當(dāng)pH<3或pH>12時(shí)，粘度下降。而原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所使用的流動(dòng)相pH≈8，故推斷導(dǎo)致色譜柱壓力升高、峰型變差和柱效下降等問題可能與卡波姆在流動(dòng)相中粘度有關(guān)。因此，樣品前處理的重點(diǎn)是盡可能地去除供試品溶液中的卡波姆。

2.2.1 濾膜篩選

將同一溶劑空白溶液分別用不同材質(zhì)的濾膜濾過后進(jìn)樣檢測(色譜條件采用原標(biāo)準(zhǔn)方法)，同時(shí)與未過濾溶劑空白圖譜進(jìn)行對比研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示PTFE的濾膜過濾后溶劑空白中未出現(xiàn)干擾峰。

取同1份樣品溶液，離心處理 5 min(10000 r/min)后，分別用不同品牌的同材質(zhì)(PTFE)同孔徑大小(0.45 μm)同規(guī)格(直徑 13 mm)的微孔濾膜濾過，分別取棄去 0、1 和 2 mL 后溶液進(jìn)樣檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示，品牌為泰坦的PTFE濾膜，對1緩釋片中雜質(zhì)幾乎無吸附，當(dāng)棄去體積為0～2 mL 時(shí)，所測雜質(zhì)總量均保持不變；而品牌為津騰的濾膜對雜質(zhì)存在吸附，隨著棄去體積的增加，雜質(zhì)總量逐步提高，當(dāng)棄去體積增加至2 mL時(shí)，雜質(zhì)總量與使用泰坦品牌濾膜所測結(jié)果一致。

2.2.2 提取溶液篩選

文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]卡波姆可與陽離子，如Na+、Ca2+和Al3+等形成沉淀。向供試品溶液中加入不同濃度的含陽離子的溶液，使卡波姆膠體形成沉淀后除去。計(jì)算新處理方法對主成分和雜質(zhì)提取率，同時(shí)考察濾過阻力。結(jié)果顯示，用CaCl2溶液和NaCl溶液處理后供試品的主成分相對于原方法提取更完全，但CaCl2溶液在溶劑峰位置存在較大干擾峰，且對雜質(zhì)的提取率偏低；1%NaCl溶液對主成分和雜質(zhì)提取率略高于2%NaCl，但2%NaCl溶液處理后供試品溶液的濾過阻力明顯小于1%NaCl溶液。

2.2.3 提取方法篩選

原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]中有關(guān)物質(zhì)供試品溶液的制備，采用“放置 2 h 后，充分振搖 10 min”，該步驟可能對1緩釋片中甲磺酸二氫麥角堿的提取率有比較大的影響，故設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證：分別稱取約 500 mg 的1緩釋片片粉，置量瓶中，加占量瓶體積60%的氯化鈉溶液，搖勻后靜置 2 h，分別以旋渦振搖5/10/15 min、搖床振搖1/2/3 h、超聲5/10/15 min 后用乙腈稀釋，測定總峰面積。結(jié)果顯示，超聲5分鐘，對主成分甲磺酸二氫麥角堿的提取率最高，且超聲方式更為便捷快速。

2.3 色譜條件的開發(fā)與優(yōu)化

2.3.1 色譜系統(tǒng)的初步建立

在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法基礎(chǔ)上，采用梯度條件對供試品進(jìn)行初步分離，經(jīng)考察，確定初始有機(jī)相體積比為10%。結(jié)果顯示主成分色譜峰峰型及主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離都得到極大改善。

2.3.2 緩沖鹽濃度優(yōu)化

將流動(dòng)相A中緩沖鹽濃度從 0.010 moL/L 降低至 0.005 moL/L 進(jìn)行試驗(yàn)，此時(shí)，色譜圖中基線漂移及干擾情況得到明顯改善，樣品中雜質(zhì)與主成分峰基本得到分離。

2.3.3 流動(dòng)相pH篩選

分別將流動(dòng)相A的pH調(diào)至2.0、2.5和3.0，其余色譜條件不變，考察1緩釋片在不同pH值流動(dòng)相中有關(guān)物質(zhì)分離情況。結(jié)果顯示，流動(dòng)相體系pH為3.0時(shí)，主峰2和主峰3間的分離度有所下降，同時(shí)雜質(zhì)的檢測靈敏度也有所下降。當(dāng)流動(dòng)相pH為2.0時(shí)，基線波動(dòng)幅度變大，故綜合考慮，選擇流動(dòng)相pH為2.5。

2.3.4 柱溫篩選

考察1緩釋片在不同柱溫下有關(guān)物質(zhì)的分離情況，和2%對照溶液在不同柱溫下的信噪比。結(jié)果顯示當(dāng)柱溫設(shè)為 40 ℃ 時(shí)，基線抬高明顯，且主峰2、3間分離度也明顯下降，而當(dāng)柱溫設(shè)為 30 ℃ 時(shí)，2%對照溶液中主峰2的信噪比下降明顯。

2.4 色譜條件優(yōu)化

2.4.1 試驗(yàn)結(jié)果

據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以柱溫、pH值、緩沖鹽濃度為自變量，以分離度(R1)、基線S/N(R2)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。中心點(diǎn)重復(fù)2次，響應(yīng)面因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

2.4.2 模型方程的建立與方差分析

應(yīng)用Design-Expert 12對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫與色譜峰分離度之間的二次多項(xiàng)回歸方程：R1= -0.0975A2-0.0075B2-0.0225C2-0.015A×B+0.025A×C-0.015B×C-0.1A+0.01B-0.0625C+1.65。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4，模型項(xiàng)P<0.01說明R1與x回歸方程的關(guān)系是極顯著的，該模型可用。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

表4 方差分析結(jié)果—分離度

對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到流動(dòng)相pH值、緩沖鹽濃度、柱溫與基線S/N之間的多項(xiàng)回歸方程：R2=0.0125A-0.6B+1.29C+18.49。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表5，模型項(xiàng)P<0.01說明R2與x回歸方程的關(guān)系是極顯著的，該模型可用。

2.4.3 響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化；根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，考查擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對分離度的影響，結(jié)果見圖1，圖1反映了三因素中任意兩因素的交互作用對分離度的影響。試驗(yàn)結(jié)果說明流動(dòng)相的pH值和緩沖鹽濃度對分離度的交互影響最大。而依據(jù)各因素對S/N的方程，可知各因素對S/N沒有交互影響。

表5 方差分析結(jié)果-信噪比

圖1 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

2.4.4 參數(shù)優(yōu)化

通過軟件分析，響應(yīng)面法優(yōu)化的分離度最佳條件以分離度、信噪比最大為目標(biāo)，做條件優(yōu)化，求出最佳色譜條件為pH值=2.3，緩沖鹽濃度為 5 mmoL/L，柱溫 36.4 ℃，此時(shí)分離度為1.63，S/N為19.4。鑒于色譜柱的耐受性pH值取2.5，柱溫取 35 ℃，緩沖鹽濃度仍為 5 mmoL/L，此時(shí)理論分離度為1.63，S/N為19.1。分離度、基線S/N可以接受。以此條件試驗(yàn)，結(jié)果分離度為1.65，S/N為19.5。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性研究

以乙腈-2%NaCl溶液(體積比2∶3)為溶劑，試驗(yàn)結(jié)果顯示空白溶劑無干擾。經(jīng)單輔料定位確認(rèn) 28 min 峰為淀粉引入，54 min 峰為丁基羥基苯甲醚引入，空白輔料典型圖譜如圖所示。

圖2 空白輔料色譜圖

圖3 輔料丁基羥基苯甲醚定位圖

圖4 供試品溶液色譜圖

2.5.2 破壞試驗(yàn)

將1緩釋片研成細(xì)粉后，分別于光照、高溫、酸、堿和氧化條件下進(jìn)行強(qiáng)制破壞，考察其降解雜質(zhì)與主成分的分離，以及物料平衡情況。結(jié)果顯示，1緩釋片的片粉在光照、高溫、酸、堿和氧化條件下均有所降解，其中酸、堿降解產(chǎn)物一致；強(qiáng)光降解的樣品外觀變黃，各降解條件下物料平衡均達(dá)到95%以上，并且在各降解條件下產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與主峰間均能達(dá)到基線分離，主峰純度檢查均符合要求。

2.5.3 定量限與檢測限

將2%對照溶液逐級(jí)稀釋后分別進(jìn)樣，計(jì)算各主峰信噪比，試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.2%對照溶液各主峰S/N值均大于10，故0.2%對照溶液為定量限濃度，0.1%對照溶液各主峰S/N值均大于3，故0.1%對照溶液可作為檢測限濃度。

圖5 強(qiáng)制降解的色譜圖

2.5.4 重復(fù)性

取定量限溶液(0.2%)，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD為1.80%，符合要求。

2.5.5 線性與范圍

取供試品溶液，稀釋制成0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液，對應(yīng)質(zhì)量濃度分別為0.41、1.025、2.05、4.10、6.15 μg/mL，分別進(jìn)樣，以主峰面積和質(zhì)量濃度作線性回歸，求得線性回歸方式為A=126625ρ+2334.8，相關(guān)系數(shù)r為0.99997，線性范圍為0.41～6.15 μg/mL(0.2%～3.0%)。

2.5.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

對照溶液、供試品溶液室溫放置 48 h 內(nèi)總峰面積的變化均小于2.0%。

2.5.7 耐用性試驗(yàn)

將波長± 2 nm、柱溫 ±2 ℃、流速 ±0.1 mL/min、初始甲醇比例±2%和流動(dòng)相pH2.5±0.2，對各條件下的結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)條件下的結(jié)果對比。各變動(dòng)色譜條件下系統(tǒng)適用性滿足要求；各變動(dòng)色譜條件下所測結(jié)果與初始條件結(jié)果相對偏差均≤5.0%。

2.6 樣品檢測結(jié)果

按照新開發(fā)的檢測方法檢測本品及近效期樣品，以原產(chǎn)品的注冊標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)限度判定。結(jié)果表明，新生產(chǎn)樣品和近效期樣品的有關(guān)物質(zhì)均在2%的限度范圍內(nèi)，符合產(chǎn)品的注冊標(biāo)準(zhǔn)。

表6 樣品的有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果

3 討論

1)本品長期24個(gè)月，質(zhì)量穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)無明顯變化；加速試驗(yàn)降解迅速，本文以加速試驗(yàn)6個(gè)月的產(chǎn)品作為有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)的樣品，所開發(fā)方法可有效分離各雜質(zhì)峰。

2)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中1緩釋片的處理方法是離心和過濾，不能有效去除卡波姆膠體。柱壓升高、柱效降低的原因可能是當(dāng)卡波姆進(jìn)入色譜柱后，卡波姆結(jié)構(gòu)中的羧基與C18柱中的硅醇基形成氫鍵而吸附在柱頭，進(jìn)而影響色譜柱的使用壽命。