基于特征成分的料香均勻性方法建立及評價*

楊乾栩，趙 蔚，謝志強，楊洪明，李 超，劉 欣，張 偉

(云南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，云南 昆明 650231)

料香均勻性是指煙絲中所添加的料和香的分布均勻程度，是影響卷煙感官均勻性的關鍵指標。目前評價料、香均勻性的手段通常以丙二醇作為標記物，部分選取薄荷醇、檸檬黃、乙基麥芽酚等[1，2]。然而，這種選取單一特征指標的評價方式具有兩方面的缺點：一是方法穩(wěn)定性不夠，單一指標往往會受較多因素的影響，使得其并非穩(wěn)健指標；二是代表性不夠，丙二醇作為料、香的重要添加劑，在料液和表香中均有較大含量，并非料或香的特征標記物，薄荷醇等通常只在表香中進行添加，底料配方中涉及較少，因此不具備較好的識別度[3]。目前雖然也發(fā)展了基于近紅外光譜[4]、圖像識別[5]等料、香均勻性檢測方法，但推廣性仍不廣泛。

為進一步建立準確、靈敏、實用的料、香均勻性的分析評價方法，本文提出了基于料、香特征組分的均勻性評價方法。通過以某規(guī)格卷煙葉組煙絲為對象，對其單獨加料和加香的樣品進行了揮發(fā)性成分分析，采用權重分析方法(Weight Analysis)[6]和選擇比例法(Selective Ratio，SR)[7]對加料和加香葉組煙絲樣本進行變量篩選分析，以煙絲中沒有且料香中含量差異較大的組分為篩選原則，確定對料、香樣本具有較強區(qū)分度的特征標記物。結果表明，篩選的料香特征標記物可有效區(qū)分料、香，通過與常規(guī)料香均勻性評價組分丙二醇和薄荷醇對比，料、香特征標記物在評價料、香均勻性上具有較高準確性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：某規(guī)格卷煙葉組煙絲、正常料液、表香。試劑：二氯甲烷(HPLC級，美國MREDA公司)；D5-吡啶(純度98%，加拿大TRC 公司)。

1.2 儀器與設備

Turbo vap Ⅱ濃縮氮吹儀(瑞典Biotage公司)；HY-8 型機械振蕩器(常州國華電器有限公司)；7890B/5977A 氣相色譜/質譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm×0.5 μm)毛細管色譜柱(美國Agilent公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣方法

分別在切絲、滾筒干燥、加香后3個工藝點取生絲、熟絲、加香煙絲樣品。為保證取樣量的均勻性和代表性，每個工藝點分別取9個樣品，其中在每個工藝點的前端、中間和后端各取3個樣品，每個樣品的取樣量不少于 100 g。

1.3.2 樣品分析

樣品前處理：稱取 2 g 煙絲于錐形瓶中，加入 30 mL 二氯甲烷，振蕩萃取 30 min，過濾煙絲后，萃取液經(jīng)氮吹濃縮至 1 mL，加入內標物D5-吡啶(3.05 μg/mL)轉移至色譜瓶中，進GC-MS進行分析。

GC-MS工作條件：色譜柱為HP-INNOWAX，進樣口溫度為 260 ℃，程序升溫：初始溫度 60 ℃，保持 2 min，以 2 ℃/min 升至 230 ℃，保持 30 min；載氣為氦氣，流量為 1 mL/min；進樣量為 1 μL，不分流進樣；電離源：EI，250 ℃；傳輸線溫度 260 ℃。

1.3.3 標記物篩選

樣品按照加料和加香不同分為兩組，色譜圖原始數(shù)據(jù)經(jīng)Zscore[8]標準化處理后，分別采用Weight Analysis和SR分析方法篩選出對料液和表香區(qū)分度較大的潛在特征標記物。

1)Weight Analysis

Weight Analysis通過計算每個變量在兩組間的方差權重，從而獲得對兩組區(qū)分能力較大的變量，詳細算法可見文獻。

2)SR分析法

SR分析法主要通過將原始變量投影后，獲取變量的解釋能力和殘差值，根據(jù)二者之比，即可獲得變量對分組的貢獻能力即SR值，SR值越大則區(qū)分能力越強，詳細介紹可參考文獻。

1.3.4 料、香均勻性評價

對不同制絲工序上的每一個加料和加香樣品，分別取前、中、后3個平行樣品，分析樣品中的標記物成分含量，并采用下述公式計算樣品的料或香的均勻性，公式見下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

標記物篩選采用Matlab r2016b完成，均勻性分析采用WPS表格完成。

2 結論與討論

2.1 加料、加香煙絲樣品的色譜分析

采用1.3.2的分析方法對加料后的煙絲樣品進行分析。根據(jù)大量樣本GC-MS定性分析結果，其中所加料液煙絲的成分主要包括糠醛、2-乙酰呋喃、薄荷醇、苯甲醛、5-甲基糠醛、丙二醇、糠醇、苯甲醇、5-羥甲基糠醛等，丙二醇是料液的通用溶劑。圖1為加料、加香煙絲樣品的分析色譜示例圖。

圖1 加料、加香煙絲樣品的GC-MS色譜示例圖

同樣對加香后的煙絲樣品進行定性分析。結果顯示，對煙絲單獨進行表香添加后，其GC-MS色譜檢測到的成分主要包括薄荷醇、丙二醇、α-大馬酮、苯甲醇、苯乙醇、2-乙酰吡咯、麥芽酚、巨豆三烯酮、乙基香蘭素等，其中丙二醇也是表香的溶劑。

2.2 含料、香的煙絲樣品標記物篩選

所考察樣本色譜圖原始數(shù)據(jù)經(jīng)Zscore標準化處理后，采用Csimpls[9]進行分析，得分圖如圖2所示。可以看出，加料樣品和加香樣品可以通過兩個潛在變量明顯分成兩類(LV1和LV2)，表明加料樣品和加香樣品在成分上具有顯著差異，可通過變量篩選(Variable/Feature Selection)[10-12]的方法獲得對料、香樣品差異貢獻較大的成分。

圖3是對料、香樣本的Weight Analysis和SR的分析結果，其中兩種方法計算所得的權重值(Weight)及SR值越大，則表明對應保留時間的成分在料、香樣本具有較大的差異，可能是區(qū)分料、香樣品的標記物。結合二者分析結果來看，在74.42、90.90和 95.38 min 3個保留時間對應的成分在加料和加香樣品具有較大含量差別。通過譜庫查詢，對74.42、90.90和 95.38 min 保留時間對應的成分進行定性，3種物質分別為棕櫚酸甲酯、亞麻酸乙酯和二十四烷。

圖2 色譜數(shù)據(jù)得分圖

圖3 料、香樣本權重分析和選擇比例分析結果

2.3 標記物含量差異及判別能力分析

圖4是初步篩選的成分對應的峰面積在不同樣品中的差別，其中0代表加香樣品、1代表加料樣品。在含量分布上，棕櫚酸甲酯在料中含量分布略高，采用Mann-Whitney-Wilcoxon 非參數(shù)檢驗[13]表明，其在料和香中含量分布差異p值為0.1162，不具有統(tǒng)計學差異；亞麻酸乙酯在香樣品中含量分布較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著的統(tǒng)計學差異(p=0.0000)；二十四烷在料樣品中含量分布較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著的統(tǒng)計學差異(p=0.0000)。

同時本文也對丙二醇和薄荷酮在料、香樣品中的含量分布進行了分析。薄荷醇在料中含量稍高，在料和香中含量分布差異p值為0.0143，具有統(tǒng)計學差異；丙二醇在香中分布含量較高，在料和香中含量分布上具有極其顯著地統(tǒng)計學差異(p=0.0000)。

圖4 所選標記物及薄荷醇、丙二醇在料、香樣品中的含量分布

可以看出，所篩選的標記物除棕櫚酸甲酯外，亞麻酸乙酯和二十四烷在料和香中含量分布具有極顯著的差異，且含量分布差異強于丙二醇，可作為潛在的料香特征標記物成分。

從不同峰面積散點圖可以看出(如圖5所示)，所篩選確定的3個成分共同用于料香區(qū)分時可以明顯區(qū)分加料和加香樣品。并且在區(qū)分能力上，二十四烷可對加料和加香樣品完全區(qū)分，識別正確率為100%；亞麻酸乙酯對料、香樣品也有極強的區(qū)分能力，識別正確率達98.15%；棕櫚酸甲酯對料香樣品區(qū)分能力一般，識別正確率達52.78%；薄荷醇和丙二醇對料香樣本區(qū)分能力一般，識別正確率分別為65.74%和83.30%。

圖5 不同料香標記物組合料、香區(qū)分散點圖

依據(jù)建立的檢測方法，亞麻酸乙酯和二十四烷的保留時間都在 90 min 以后，化學性質較為相近，可建立合適的方法進行分離，且二者在料和香樣品中含量分布剛好相反，因此選擇亞麻酸乙酯和二十四烷作為料、香均勻性評價標記物。

2.4 料、香均勻性評價方法應用

圖6反應了不同標記物在制絲段不同工序對應樣品的檢測結果。整體來看，所選標記物對不同工序料香均勻性的評價結果較一致，除個別離閾值外，加料、滾筒干燥和加香工序的料香均勻度整體上均可達0.8以上；薄荷醇和丙二醇對不同工序料香均勻度的評價結果較差，二者在不同工序上的料香均勻度評價存在較大波動。

圖6 不同標記物在不同工序檢測折線圖

表1對比了所篩選確定的特征標記物成分與常規(guī)標記物丙二醇和薄荷醇的料香均勻性評價結果。其中采用亞麻酸乙酯和二十四烷成分評價，二者在不同階段的評價結果較為一致，均表現(xiàn)為滾筒干燥工序料香均勻性最高，加料階段其次，加香階段最差。采用薄荷醇評價，加料工序料香均勻性最高，加香工序其次，滾筒干燥工序最差。而采用丙二醇評價，則呈現(xiàn)出加香工序料香均勻性最高，滾筒干燥工序其次，加料工序最差的結果。從不同工序料香均勻性的具體數(shù)值來看，亞麻酸乙酯和二十四烷對加料、滾筒干燥和加香工序的均勻性評價結果較為吻合，二者評價結果的皮爾森相似性達0.999，而薄荷醇和丙二醇的評價結果則相似性較差，僅有0.136。

表1 方法穩(wěn)定性考察結果

對于制絲工序，加料、滾筒干燥、加香是依次進行的加工過程，其中料液是加料工序階段添加，表香的添加則在加香工序階段。從實際經(jīng)驗來看，滾筒干燥相對于加料工序經(jīng)過進一步的混合，其料香均勻性要高于加料工序。而在加香工序，由于額外添加了表香，尚未經(jīng)過充分制絲工藝的混合，因此其料香均勻性會有一定程度降低。

因此從上述分析結果來看，所篩選的亞麻酸乙酯和二十四烷針對不同制絲工序料香均勻性的評價結果與實際經(jīng)驗較為一致，而薄荷醇和丙二醇與實際經(jīng)驗均存在一定偏差，表明所篩選確定的標記物可以較好的表征料香在葉組煙絲中的分布均勻性。

3 結語

料、香均勻性評價是煙草行業(yè)較為重視的問題，現(xiàn)有研究所提及的均勻性評價方法在靈敏度、準確度和實用性上尚存在不足。本研究采用化學計量學變量篩選手段，篩選了料、香中的特有標記物，并首次以料、香特有標記物為切入點，建立了基于料、香標記物的均勻性評價方法。相比于常規(guī)丙二醇、薄荷醇作為評價標記物，所篩選確定的亞麻酸乙酯和二十四烷表現(xiàn)出較優(yōu)的均勻性評價結果：一方面，亞麻酸乙酯和二十四烷特征標記物，二者在不同工序的均勻性評價結果，表現(xiàn)出較好的一致性和穩(wěn)定性，另一方面，這兩個特征標記物對不同工序的料、香均勻性評價結果，與實際生產(chǎn)認知更為吻合。因此，本文提出的采用料香特征標記物用于評價加料、加香樣品分布均勻性的方法，為料香均勻性評價的標記物發(fā)現(xiàn)提供了新思路。