磁改性D151陽離子交換樹脂純化黃柏小檗堿*

武佳盈，侯夢夢，馮浩恩，張翠利

(黃河科技學院，河南 鄭州 450063)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，習稱“川黃柏”[1]。黃柏的主要化學成分為黃酮類和生物堿類，其中生物堿是黃柏的主要有效成分，且含量最高[2]。黃柏生物堿中的小檗堿(Berberine)，屬于異喹啉生物堿，應用最廣，是黃柏活性成份中最有價值的單體[3]，具有多種藥理作用，包括抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、心臟保護、降血糖、調節脂質代謝以及免疫抑制等[4-7]。另外張莉和呂曉楠等證明黃柏提取物對食品和水果的腐敗菌也有很好的抑制作用[8-11]。

目前小檗堿的純化方法有溶劑法、大孔吸附樹脂法和離子交換樹脂法等[12-13]，這些方法有的需要大量有機溶劑，造成環境污染；有的需要裝柱、上樣、洗脫及檢測等步驟，操作繁瑣。磁改性的離子交換樹脂是一種磁性高并且較穩定的磁性材料，由于其骨架中含有無機磁性組分，可加速沉降分離，提高操作效率[14-16]，可用于天然產物有效成分的富集和純化，操作簡單高效。同時無機磁性組分可能存在與小檗堿作用的活性位點，能提高吸附率。

目前關于磁改性的離子交換樹脂用于黃柏中小檗堿的純化還未見報道。本研究以小檗堿吸附率為指標，考察了磁性D151陽離子交換樹脂純化黃柏中小檗堿的工藝研究，為黃柏生物堿的精制工藝提供依據。

1 儀器與試劑

FA1004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)、T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、丹瑞HH-2數顯恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實驗儀器廠)、JJ-1增力電動攪拌器(上海梅香儀器有限公司)、電爐(上海樹立儀器儀表有限公司)。

黃柏(安徽亳州)、大孔弱酸性陽離子交換樹脂D151(國家高新技術企業)、乙醇(煙臺市雙雙化工有限公司)、硫酸(洛陽市化學試劑廠)、鹽酸(洛陽昊華化學試劑有限公司)、氫氧化鈉(天津市科鄭州派尼化學試劑廠)、甲苯(洛陽市化學試劑廠)、乙醚(煙臺市雙雙化工有限公司)、FeCl3·6H2O(密歐化學試劑有限公司)、FeCl2·4H2O(天津市光復精細化工研究所)、鹽酸小檗堿對照品(批號：110713)，以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 小檗堿母液的制備

采用醇提法對黃柏中小檗堿進行提取[17]。稱取干燥黃柏粉末 20 g，置于 500 mL 圓底燒瓶中，加入7倍體積70%乙醇，加熱回流 1.5 h，提取2次，過濾，合并濾液。將濾液濃縮至無醇味，濃縮液中加入硫酸，使硫酸質量分數為0.5%，過濾。將濾液定量轉移至 250 mL 的容量瓶中，用0.5%H2SO4定容，制得小檗堿母液(pH值約為3)。

2.2 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制

精密稱取鹽酸小檗堿對照品 2.5 mg，置 50 mL 的容量瓶中，用質量分數0.5%硫酸溶液溶解，并用質量分數0.5%硫酸稀釋定容得 0.25 mg/mL 對照品儲備液。精密吸取貯備液 1、3、5、7、10 mL，分別置于 100 mL 容量瓶中，用質量分數0.5%硫酸溶液定容至刻度線，在 421 nm 波長處測定各溶液的吸光度(A)值。 以吸光度 (A)值為縱坐標，小檗堿質量濃度 (mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程A=13.04C+0.04 (R2=0.999)，小檗堿質量濃度為 0.0025 mg/mL～0.025 mg/mL 范圍內與吸光度線性關系良好。結果見圖1。

圖1 小檗堿的標準曲線

2.3 樹脂的預處理

取D151陽離子交換樹脂 5 g，置干燥的 250 mL 錐形瓶中，加入約5倍樹脂量的無水乙醇浸泡 1 h，棄去浸泡液，用蒸餾水沖洗至無醇味，再用5%的鹽酸溶液 20 mL 浸泡 1 d 后用蒸餾水沖洗至中性，最后用4%NaOH溶液 20 mL 浸泡 1 d，蒸餾水沖洗至中性，備用[18]。

2.4 磁性D151陽離子交換樹脂的制備

目前，磁性陽離子交換樹脂的制備方法主要用化學共沉淀法，單體聚合法和化學轉化法等[19-20]。本實驗采用化學共沉淀法來制備磁性陽離子交換樹脂。將 0.1 mol/L 的FeCl3·6H2O溶液 33 mL、0.1 mol/L 的FeCl2·4H2O溶液 66 mL、預處理過的樹脂 5 g、蒸餾水 20 mL 分別置于氮氣保護的三頸瓶中，在 50 ℃ 水浴的條件下，以 600 r/min 的攪拌速度攪拌 5 min，緩慢滴加濃度為 1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，至混合液pH為8，并繼續攪拌 1.5 h。將反應液轉移到燒杯中，反復用蒸餾水清洗至無色，再用乙醇清洗3次，低溫下干燥得磁性D151陽離子交換樹脂，備用。

2.5 磁性交換樹脂對小檗堿的吸附及吸附率的測定方法

稱取制備的磁性樹脂 5 g，分別置于 250 mL 錐形瓶中，精密量取小檗堿母液 25 mL 置于錐形瓶中，每 30 min 振搖 1 min，在不同條件下進行吸附、過濾得濾液。紫外分光光度法分別測定濾液和母液的吸光度A，代入標準曲線計算出母液中小檗堿的濃度(C0)和吸附后濾液中小檗堿的濃度(C1)，計算樹脂對小檗堿的吸附率(%)，計算公式見公式(1)：

吸附率(%)=(C0-C1)×100%/母液濃度

(1)

2.6 單因素試驗

以磁性樹脂對小檗堿的吸附率為考察指標，通過單因素試驗考察小檗堿初始質量濃度(0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02 mg/mL)、溶液pH值(2、4、6、8、10)、吸附時間(1、1.5、2、2.5、3 h)、吸附溫度(15、25、35、45、55 ℃)這幾個因素，考察各因素對吸附率的影響。

3 結果與分析

3.1 小檗堿初始濃度對吸附率的影響

稱取制備的磁性樹脂 5 g 5份，置于5個 250 mL 錐形瓶中，分別精密量取pH值為4的小檗堿母液 25 mL(質量濃度分別為 0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02 mg/mL 五個水平)置于錐形瓶中，在 35 ℃ 條件下吸附 2 h。采用2.5項下的方法測定不同濃度下磁性樹脂的吸附率，結果見圖2。

圖2 小檗堿初始質量濃度對吸附率的影響

由圖2可知，母液質量濃度小于 0.015 mg/mL 時，隨著母液濃度增大，磁性樹脂吸附小檗堿的能力增加。母液質量濃度大于 0.015 mg/mL 時，隨著濃度的增大，磁性樹脂對小檗堿的吸附率略降低。當母液質量濃度為 0.015 mg/mL 時，吸附率達到最高91.05%。

3.2 pH值對吸附率的影響

稱取制備的磁性樹脂 5 g 5份，置于5個 250 mL 錐形瓶中，再分別精密量取用硫酸或氫氧化鈉調節的pH值分為2、4、6、8、10的 0.015 mg/mL 小檗堿母液 25 mL，置于錐形瓶中，在 35 ℃ 條件下吸附 2 h。采用2.5項下的方法測定不同pH值下磁性樹脂的吸附率，結果見圖3。

圖3 pH值對吸附率的影響

由圖3可知，pH值為6時，磁性樹脂對小檗堿的吸附能力最強，吸附率達90.54%。pH值小于6時，吸附率隨著溶液pH值的增大而增加。pH值大于6時，隨著pH值的增大，吸附率隨之下降。

3.3 吸附時間對吸附率的影響

稱取制備的磁性樹脂 5 g 5份，置于5個 250 mL 錐形瓶中，再分別精密量取pH值為6的 0.015 mg/mL 小檗堿母液 25 mL，置于錐形瓶中，在 35 ℃ 條件下進行吸附，吸附時間分為 1、1.5、2、2.5、3 h 5個水平。采用2.5項下的方法測定不同吸附時間下磁性樹脂的吸附率，結果見圖4。

圖4 時間對吸附率的影響

由圖4可知，吸附時間低于 2.5 h 時，對小檗堿的吸附率隨著時間增長而升高。時間超過 2.5 h 時，吸附率下降，時間為 2.5 h 時，樹脂的吸附率高達90.52%。

3.4 溫度對磁性D151陽離子交換樹脂吸附小檗堿的影響

稱取制備的磁性樹脂 5 g 5份，置于5個 250 mL 錐形瓶中，再分別精密量取pH值為6的 0.015 mg/mL 小檗堿母液 25 mL，置于錐形瓶中，在不同溫度(15、25、35、45、55 ℃ 五個水平)下進行吸附 2 h。采用2.5項下的方法測定不同吸附溫度下磁性樹脂的吸附率，結果見圖5。

圖5 溫度對吸附率的影響

由圖5可知，吸附率隨著吸附溫度的增加而不斷上升，在 35 ℃ 時達到最佳，吸附率為90.53%，之后隨著溫度的增加而吸附率下降。由圖中可以看出溫度過高或者過低時，都會影響磁性樹脂對小檗堿的吸附。

3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，用正交試驗對吸附因素(母液濃度、pH值、時間、溫度)進行優化，按照表1正交試驗設計L9(34)測定磁性樹脂對小檗堿的吸附，正交結果及方差分析見表2和表3。

表1 正交試驗設計L9(34)

表2 正交試驗直觀分析

表3 方差分析

根據表2中數據的分析可知，A2B3C2D2為磁性樹脂對小檗堿的最佳吸附條件，即母液的質量濃度為 0.015 mg/mL、pH值8、吸附時間 2.5 h、吸附溫度為 35 ℃。由極差分析可知，吸附因素對吸附率影響大小依次為：母液的濃度>吸附時間>吸附溫度>pH值。

3.6 小檗堿的洗脫

取吸附小檗堿的磁性樹脂，使用蒸餾水反復沖洗，直到洗液為無色為止。然后精密量取70%乙醇溶液 25 mL 進行浸泡洗脫，之后每隔 30 min 振搖 1 min，2.5 h 后用紫外分光光度計測定洗脫液的吸光度A，并代入標準曲線計洗脫液中小檗堿的濃度C2，按公式(2)計算解吸附率(洗脫率)。

洗脫率%=[C2/(C-C1)]×100%

(2)

注：公式(2)中，C為小檗堿母液的濃度，C1為磁性樹脂吸附后濾液中小檗堿的濃度，C2為洗脫液中小檗堿的濃度。

4 驗證性試驗

稱取制備的磁性樹脂 5 g，3份，置于3個 250 mL 錐形瓶中，在上述最佳條件下進行小檗堿的吸附，分別精密量取pH值為8的 0.015 mg/mL 小檗堿母液 25 mL，置于錐形瓶中，在 35 ℃ 條件下每隔 30 min 振搖 1 min，每分鐘振搖30次，2.5 h 后過濾，用紫外分光光度計測定濾液中小檗堿的濃度。然后取用上述吸附過小檗堿的磁性樹脂，使用蒸餾水反復沖洗，直到洗液為無色為止。精密量取70%乙醇溶液 25 mL 進行洗脫，每隔 30 min 振搖 1 min，2.5 h 后計算測定出洗脫液中小檗堿的濃度，按照公式(1)和公式(2)分別計算吸附率和洗脫率，結果見表4，由結果可知該方法結果準確可靠。

表4 磁性樹脂對小檗堿的吸附率與洗脫率

5 結論

通過單因素和正交試驗確定了磁性樹脂對小檗堿的最佳吸附參數，當小檗堿的母液質量濃度為 0.015 mg/mL，溶液的pH值為8、吸附時間 2.5 h、吸附溫度為 35 ℃ 時，磁性D151陽離子交換樹脂對小檗堿具有最佳的吸附能力。吸附率高達91.11%，較未磁化樹脂吸附率85.76%有一定的提高，可能為磁化時生成的Fe3O4對小檗堿也存在一定的吸附位點。所以，磁性離子交換樹脂較離子交換樹脂具有分離快速、吸附率高、易解吸附、操作簡單等優點，在天然產物活性純化方面具有較好的應用前景。