基于網絡藥理學探究“葫蘆巴-迷迭香”提取物治療Ⅱ型糖尿病的潛在作用機制及實驗驗證*

張彥昕，柴貝貝，石玉節，李海利

(1.鄭州賽科藥業科技有限公司，河南 鄭州 450000；2.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450000)

近年來，全世界范圍內糖尿病的患病率約為10%，糖尿病是一種表現為高血糖的代謝病，由胰島素分泌異常、胰島素抵抗或這兩種因素共同導致，其中Ⅱ型糖尿病(T2DM)高達90%。發展到一定程度可以出現許多并發癥[1]，作為全球流行病，T2DM對世界各國人民健康造成極大危害[2]，被評為世界第四大易致死性疾病。

葫蘆巴是豆科屬的一種草本植物，又名胡盧巴，具有多種生物功效，中醫常用于溫腎補陽、祛寒止痛。近幾年有研究發現葫蘆巴堿與胰島素分泌、參與糖代謝過程酶的活性、體內活性氧、神經元興奮性等密切相關[3]，盧芙蓉等[4]探究葫蘆巴總皂苷可以抑制鏈脲佐霉素誘導大鼠血小板聚集和血小板活化同時可以降低血糖升高胰島素水平。葫蘆巴的種子有助于降低食物中血糖負荷的成分，從而減少碳水化合物和單糖對血糖的影響[5-6]。

迷迭香是一種芳香的常綠灌木植物，屬于唇形科，原產于地中海地區和南美洲，其鮮葉和干葉已被廣泛用于調味和傳統藥物。歷史上，迷迭香被用作藥物治療腎絞痛和痛經、刺激頭發生長、緩解呼吸系統疾病。在現代醫學，迷迭香提取物經常用于治療與焦慮相關的疾病，同時藥理學研究表明，迷迭香提取物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和抗高血糖的特性[7-12]。

中藥具有多途徑、多成分、多靶點的特點，網絡藥理學方法能夠從中藥調控的整體進行分析，具有快速高效的特點，因此被越來越廣泛的應用到中藥藥理作用解析中[13-16]。本研究基于網絡藥理學特點，構建“葫蘆巴-迷迭香”治療Ⅱ型糖尿病蛋白網絡，解析其治療Ⅱ型糖尿病的作用機制，并通過動物實驗進一步驗證。

1 網絡藥理學研究

1.1 中藥活性成分及其靶點收集

運用 BATMAN-TCM數據庫，以拉丁名檢索，收集葫蘆巴和迷迭香所有的有效活性基因分子，在設置參數處設定P值為0.1進行篩選，得到其有效活性成分；用PubChem數據庫獲取各活性成分的SMILES號，導入SwissTarget Prediction數據庫預測各成分對應的靶點。

1.2 疾病靶點收集

以“Type 2 diabetes”為關鍵詞，使用GeneCards靶點數據庫(篩選條件：相關性>40)、OMIM數據庫、DisGeNET數據庫搜索及篩選糖尿病的靶標基因，刪除重復靶點，得到Ⅱ型糖尿病相關疾病靶點。

1.3 葫蘆巴-迷迭香治療Ⅱ型糖尿病的靶點預測(韋恩圖)

利用韋恩圖制作在線網站繪制出“葫蘆巴-迷迭香”作用靶點與Ⅱ型糖尿病疾病靶點交集的韋恩圖。

1.4 葫蘆巴-迷迭香治療Ⅱ型糖尿病蛋白質互作網絡(PPI)構建

為清楚地解析“葫蘆巴-迷迭香”與糖尿病之間的蛋白信息，將葫蘆巴-迷迭香和疾病靶點合集導入STRING在線數據庫，選定物種為“智人”，中等置信度設置>0.7，進行靶點PPI網絡圖構建。

1.5 基因本體(GO)及通路分析

為了研究“葫蘆巴-迷迭香”中活性成分的靶點在基因和通路的作用，利用Metascape網站輸入重復靶點基因，依據P<0.01，篩選“葫蘆巴-迷迭香”治療Ⅱ型糖尿病的信號通路和生物過程并進行分析，利用微生信在線平臺生成基因富集氣泡圖。

成語中還有很多古今異義的現象，比如“走馬觀花”中的“走”是“跑”的意思，而非“行走”之意。“赴湯蹈火”中的“湯”是“開水”的意思，并不是“菜湯”之意?！案屑ぬ榱恪敝械摹疤椤笔恰把蹨I”之意，并不是“鼻涕”之意。

2 實驗研究

2.1 實驗動物

雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠50只(200±20)g，購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0008。飼養于焦作賽科動物實驗中心，飼養環境：室溫(25±2)℃，12 h 黑暗/12 h 人工光照，標準飼料喂養，自由飲水，適應性飼養一周。

2.2 試劑與儀器

葫蘆巴和迷迭香提取物(HMTQW)由鄭州賽科研發中心提取純化得到，復配為低劑量(0.5 g/kg)、中劑量(1.0 g/kg)、高劑量(2.0 g/kg)；鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma)；檸檬酸、檸檬酸鈉(天津市恒興化學試劑制造有限公司)；甘油三酯試劑盒(TG)、膽固醇試劑盒(TC)、低密度脂蛋白試劑盒(LDL-C)、高密度脂蛋白測定試劑盒(HDL-C)(均購于上?？瓢┥锛夹g有限公司)；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(賽默飛世爾)；多功能酶標儀(TECAN 瑞士)。

2.3 動物分組及造模

1)動物分組 將50只健康SD大鼠隨機分為空白組、Ⅱ型糖尿病模型組和HMTQW低、中、高劑量治療組，每組10只。

2)糖尿病模型的建立 空白組正常飲食，模型組和給藥組大鼠使用高糖高脂飼料喂食8周，術前禁食 12 h，腹腔注射2%STZ，劑量 45 mg/kg，空白組腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液。注射七天后，大鼠尾靜脈采血，測量空腹血糖，判斷標準為血糖范圍≥13.0 mmol/L，同時出現多飲、多食、多尿現象，表明模型建立成功。

3)實驗給藥 模型建立成功次日開始藥物治療，每天灌胃給藥2次，連續給藥4周。

3 結果

3.1 篩選中藥活性成分及其靶點收集

BATMAN-TCM數據庫設置參數后得到“葫蘆巴-迷迭香”有效活性成分56個，其中葫蘆巴的活性成分33個，迷迭香的活性成分23個，經篩選(活性成分與靶點相關度>0.1)后得到靶點764個。

3.2 疾病靶點篩選結果

通過Genecards、DisGeNET數據庫檢索“Type 2 diabetes”得到相關基因，收集基因信息(Relevance Score>40)，刪除重復基因后共獲得554條基因結果。

3.3 中藥治療疾病靶點韋恩圖

將活性成分靶點與T2DM 靶點繪制韋恩圖(見圖1)，二者重合區域即為交集基因，得到126個靶基因。

3.4 蛋白質互作網絡(PPI)構建及其核心基因分析

交集靶點互作(見圖2)共得到126個節點，726條邊，平均節點度值12.1，局部聚類系數0.484。說明“葫蘆巴-迷迭香”提取物治療 T2DM 的作用機制可能與這 126個潛在靶點有關。蛋白交互篩選到關鍵靶點如表1所示。

圖1 藥物活性成分與疾病靶點韋恩圖

注：節點為交集靶點蛋白，邊為蛋白之間的互作關系圖2 “葫蘆巴-迷迭香”提取物與 疾病交集靶點的蛋白互作網絡圖

表1 部分關鍵靶點

3.5 基因富集與通路結果分析

取前20位進行GO分析和KEGG通路富集分析(見圖3)，GO富集共確定了497個條目，其中細胞組分富集有95條，包括膜筏、膜微結構域、質膜筏、受體結合物等；分子功能富集有134條，包括蛋白激酶活性、配體激活轉錄因子活性、磷酸轉移酶活性、磷酸酪氨酸活性等；生物過程富集有268條，包括正向細胞因子遷移、血管生長、上皮細胞增殖等。KEGG通路分析主要涉及 癌癥通路、AGE-RAGE 信號通路、糖尿病心肌炎、鈣通道、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、HIF-1信號通路等。通路與富集靶點數目見表2。

圖3 GO、KEGG富集結果

表2 靶向通路及其靶點數目

3.6 網絡圖構建

“葫蘆巴-迷迭香-活性成分-靶點”網絡圖如圖4，“葫蘆巴-迷迭香-活性成分靶點-疾病靶點-疾病”網絡圖如圖5。

注：綠色節點是藥物，黃色節點是活性 成分，紅色節點是靶點圖4 “葫蘆巴-迷迭香-活性成分-靶點”網絡圖

注：黃色節點是藥物，紅色節點是成分靶點， 綠色節點是疾病，紫色節點是疾病靶點圖5 “葫蘆巴-迷迭香-活性成分靶點-疾病 靶點-疾病”網絡圖

3.7 動物實驗研究結果

3.7.1 空腹血糖水平比較結果

與空白組比較，糖尿病模型組的血糖明顯升高，給藥低劑量組結果有下降趨勢，但未見顯著性差異，中劑量與高劑量給藥組與模型組相比可降低大鼠血糖水平，見圖6。

與空白組比較，###P<0.001； 與模型組比較，***P<0.001，**P<0.01圖6 大鼠空腹血糖水平比較 (n=10)

3.7.2 血清中甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平結果

與空白組比較，糖尿病模型組血清中總甘油三酯和總膽固醇升高，高密度脂蛋白膽固醇降低，低密度脂蛋白膽固醇升高，與模型組相比，給藥組低劑量沒有顯示出明顯降低血清中總甘油三酯的作用，給藥組中劑量和高劑量具有一定作用，如圖7(a)；與模型組相比，給藥組低劑量和中劑量沒有顯示出明顯降低血清中總膽固醇的作用，高劑量給藥干預后，大鼠血清中總膽固醇下降，如圖7(b)；與空白組比較，模型組的高密度脂蛋白膽固醇降低，低密度脂蛋白膽固醇升高，經給藥后可看出低劑量組結果與模型組沒有顯著性差異，中劑量和高劑量組顯示出良好的干預效果，如圖7(c)、 7(d)。

(a) (b) (c) (d)

3.7.3 血清中炎性因子，血管內皮細胞生長因子和表皮細胞生長因子水平結果

與空白組比較，糖尿病模型組血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平顯著升高，VEGF及EGF含量明顯降低；與糖尿病模型組相比，HMTQW低劑量組沒有明顯差異，HMTQW中劑量和高劑量組血清中的IL-6、IL-2、TNF-α水平下降，VEGF和EGF水平均明顯升高，具有統計學意義，見圖8與圖9。

(a) (b) (c)

(a) (b)

4 討論

葫蘆巴與迷迭香中所含有的多種化合物發揮著穩定且多樣的植物藥理學功能，廣泛用于香料、食品、醫藥行業。血脂、膽固醇升高，急、慢性并發癥，血糖水平異常，胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病患者顯著的特征。

4.1 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可降低血脂、血糖

與癌癥通路相關的凋亡細胞如MAPK1和MMP9等在肥胖、糖尿病等疾病中發揮重要作用[17]。體外研究表明，迷迭香具有胰島素樣作用，可抑制肝細胞產生葡萄糖，顯著抑制HepG2肝細胞的糖異生。在另一項研究中，迷迭香提取物調節AMPK和PPAR信號通路增加肝細胞的葡萄糖消耗。此外，細胞內糖原含量顯著降低，糖酵解率增加[18-20]。

4.2 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可減少糖尿病并發癥

糖尿病視網膜病變是糖尿病的微血管并發癥。在糖尿病微血管系統中，細胞內高血糖通過炎癥反應、內皮細胞與足細胞的交互作用以及外泌體等多種病理生理過程導致血管內皮損傷。

作為代謝最活躍的組織之一，視網膜對生物機體血糖水平的波動極其敏感。視網膜內皮細胞因缺血、氧化應激和促炎因子的釋放而受損。TNF是糖尿病視網膜病變相關研的關鍵靶標，參與與肥胖有關的Ⅱ型糖尿病的生理、病理過程[21]，研究表明，IL-1、TNF-b、VEGF和NF-kB均可刺激內皮細胞ICAM-1和VCAM-1的表達[22-24]。GO富集關鍵靶點血管內皮因子A(VEGFA)對血管內皮細胞的分化、增殖和存活尤其重要，可促進內皮依賴性血管舒張和提高血管通透性[25]。葫蘆巴中劍麻皂素可上調VEGFA表達，從而減少患者視網膜病變的發生。

PI3K/Akt/mTOR通路是糖尿病腎病的重要通路，患者體內異常糖代謝發生時，PI3K/Akt信號通路刺激葡萄糖的轉運，當相關蛋白表達上調時會傳導至葡萄糖轉運蛋白4受體分子，從而激活葡萄糖轉運蛋白4，易位至細胞膜，將葡萄糖轉運至細胞內。網絡藥理學探究發現迷迭香中的木犀草素、槲皮素、香葉木素和葫蘆巴中的一些黃酮、皂苷類可抑制PI3K/Akt信號通路，減少細胞內的葡萄糖[26-28]。

4.3 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可增強血糖調節能力

II型糖尿病患者體內一般會含有大量不可逆糖基化終產物(AGEs)，高水平的AGEs會損傷胰島 β 細胞功能，誘導其凋亡。AGE-RAGE信號通路可激活下游核轉錄因子(NF-KB)，抑制CASP3酶的活性，迷迭香提取物抑制胰島β細胞的凋亡，改善胰島β細胞的分泌功能，增加胰島素分泌量并提高患者內源性血糖調節能力[29-30]。從“藥物-活性成分-靶點”網絡圖中可知，迷迭香中鼠尾草酸、迷迭香酸發揮了調節血糖的能力，同時，酚酸類物質還可以抑制α-葡萄糖苷酶活性來降低葡萄糖的吸收速率[31-32]。

4.4 “葫蘆巴-迷迭香”提取物可改善體內胰島素抵抗

酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)與酪氨酸蛋白激酶一起控制參與細胞生長、代謝、分化、增殖和存活的信號通路，I型酪氨酸蛋白磷酸酶非受體(PTPN1)是一種酪氨酸磷酸酶，作為一種胰島素信號通路負調控因子，PTPN1、PTPN2、PTPN9、PTPN11、PTPRS和DUSP9等PTPs可干擾胰島素信號傳導并觸發T2DM[33]，Sun等[34]實驗驗證了這一可能存在的藥物靶點，抑制與胰島素抵抗相關的PTPN1，PTPN9，PTPN11和PTPRS的催化活性，減少胰島素抵抗，從而達到降低血糖的效果。

AKT1、AKT2參與葡萄糖代謝在內的細胞過程，與糖尿病、炎癥反應等多種疾病的發生密切相關。細胞因子介導的炎癥反應可能引起胰島素抵抗，研究顯示IL-6、TNF在糖尿病患者體內表達顯著升高，炎性因子過度表達與胰島素抵抗程度呈正相關，導致胰島素分泌功能障礙[35]。葫蘆巴中的黃酮類化合物(葫蘆巴堿、柚皮素、異葒草素等)具有抗氧化和抗炎作用，可降低IL-6和腫瘤壞死因子-α的合成及分泌，進而抑制炎性遞質的產生，改善胰島素抵抗。同時這與動物實驗研究結果相符合。

綜上，中藥“葫蘆巴-迷迭香”治療T2DM具有可行性，作為藥食同源的葫蘆巴和迷迭香目前在臨床上的應用研究還較少，動物實驗選擇了幾個典型性指標進行檢測，解釋了“葫蘆巴-迷迭香”提取物可調節血脂代謝、減少炎癥反應，從而達到降糖的作用。