凝脂蓮香精成分分析及最優(yōu)提取方式研究

陶厚璜，周泓彬，郭明

( 浙江農(nóng)林大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 杭州 311300）

景天科Crassulaceae 多肉植物可以散發(fā)出香味[1]，比如凝脂蓮Sedumclavatum，原產(chǎn)于墨西哥，生長(zhǎng)于巖壁或安山巖上，現(xiàn)已在世界多地廣泛種植[2]。在經(jīng)過人類百年的培育后，基因穩(wěn)定[3]，生產(chǎn)鏈完善。在國內(nèi)屬于多肉植物中的入門級(jí)品種，價(jià)格低，產(chǎn)量又高[4]，因其經(jīng)過日曬后香味更加濃郁，成為多肉香精提取的主要對(duì)象[5]。多肉香精的提取不僅可以直接解決部分多肉植物現(xiàn)階段價(jià)格低迷、供大于求的問題，還可以解決農(nóng)民囤積的問題，為農(nóng)戶們帶來新的創(chuàng)收，同時(shí)可為我國多肉產(chǎn)業(yè)鏈調(diào)整提供參考[6]。

對(duì)相關(guān)精油的提取，現(xiàn)國內(nèi)主要采用的是微波輔助水蒸氣法（Microwave Assisted Hydro-distillation，MAHD）[7]，相較于傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法（Steam distillation，HD）存在提取過程長(zhǎng)，提取原料需要加熱，不適用于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定組分提取的問題[8]，MAHD 既有水蒸氣蒸餾法設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作和易分離純化的優(yōu)點(diǎn)[9]，又結(jié)合了微波輔助技術(shù)對(duì)某些組分的高效選擇性和省時(shí)、產(chǎn)物提取率高的特點(diǎn)，兩者結(jié)合可以大大加快香精提取的速度以及提高產(chǎn)物的提取率[10]。MAHD 已經(jīng)在天然產(chǎn)物的提取中有過較多報(bào)道，是一種可靠的方法，而關(guān)于其在景天科多肉植物香精提取研究則較為少見[11]。

本文通過MAHD 法提取凝脂蓮香精，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析儀[12]分析和鑒定原植株香精與葉片、莖稈香精化學(xué)成分的差異，對(duì)比三者成分，探求三者的關(guān)系；同時(shí)，利用單因素試驗(yàn)法[13]，探討固液比、浸泡時(shí)間、微波功率、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)香精提取率的影響，總結(jié)凝脂蓮香精的最佳提取條件，得出最高提取率。目前，已發(fā)現(xiàn)景天科多肉植物相對(duì)于其他多肉植物的香精揮發(fā)性物具有抑菌[14]、抗氧化、消炎、抑制細(xì)胞毒性[15]等作用。本文也希望提取出的香精在幫助種植戶們解決囤積問題，增加收入的同時(shí)，能為植物種植領(lǐng)域[16]做出獨(dú)特的貢獻(xiàn)，成為一項(xiàng)有意義的研究。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)儀器

試驗(yàn)所用凝脂蓮購于山東欣美多肉植物種植基地。取新鮮凝脂蓮的地上部分，將葉片和桿莖分別切出小口，避免在干燥過程中爆裂[17]，再放入干燥箱中，初始溫度定為40 ～ 50 ℃，時(shí)間為2 h，中期控制溫度在55 ℃左右，放置10 h，后期升溫至60 ℃，等待5 h，最后取出并趁熱使用粉碎機(jī)分別粉碎，得到的產(chǎn)物使用目篩篩至10 目，隨后及時(shí)使用密封袋裝取備用。

試驗(yàn)所用試劑無水硫酸鈉、異丙醇（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

真空干燥箱（北京益康科學(xué)儀器有限公司）；XH-300A 微波-超聲波合成萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（Agilent，美國）。

1.2 微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮精油

分別準(zhǔn)備25 g 的凝脂蓮葉片及桿莖干樣和200 g 蒸餾水即固液之比為1∶8，將干樣浸泡到蒸餾水中，等待2 h，結(jié)束后加入至微波-超聲波合成萃取儀中，上端連接冷凝管和揮發(fā)油測(cè)定器進(jìn)行微波輔助-水蒸氣蒸餾。微波提取功率為400 W，無餾分蒸出后關(guān)閉微波提取裝置，收集冷卻至室溫后的精油，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后得到凝脂蓮葉片及桿莖香精[18]，精確稱量其質(zhì)量并記錄，密封后保存于4 ℃冰箱。計(jì)算凝脂蓮精油提取率：

式（1）中，mg是脫水后香精的質(zhì)量，mo是凝脂蓮使用的質(zhì)量。

1.3 香精成分分析測(cè)定條件

1.3.1 植株香精成分測(cè)定-頂空固相微萃取[19]

（1）將一年生的新鮮凝脂蓮植株清洗干凈晾干，把植株均勻剪成小粒，稱取1.0 g 放入頂空瓶，加入9 mL蒸餾水，插入萃取頭于45 ℃下萃取，時(shí)間30 min，在氣相色譜儀進(jìn)樣口250 ℃下熱解析6 min，啟動(dòng)氣質(zhì)儀采集，進(jìn)行GC-MS 分析。

（2）氣相色譜條件[18]：RTX-5MS 型彈性石英毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純度氦氣（99.999%），柱內(nèi)載氣流量1.30 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度230 ℃。升溫程序：從60 ℃開始保持2 min；以4 ℃·min-1升溫至80 ℃，保持1 min；再以10 ℃·min-1升溫至120 ℃，保持1 min；以5 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持1 min；最后以20 ℃·min-1升溫至220 ℃；不分流進(jìn)樣。

（3）質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓0.9 kV；溶劑延時(shí)5 min；掃描范圍35 ～ 600 m·z-1。

1.3.2 葉片和莖稈香精成分測(cè)定

（1）在1 mL 異丙醇中溶解100 μL 葉片或莖稈的香精，充分震蕩搖勻作為待測(cè)液，進(jìn)行GC-MS 分析。

（2）氣相色譜條件：同1.3.1（2）中的條件。

（3）質(zhì)譜條件：同1.3.1（3）中的條件。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

通過1.2 節(jié)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莖稈香精提取率遠(yuǎn)高于葉片，所以單因素實(shí)驗(yàn)只考慮莖稈香精的提取率。按照1.2節(jié)方法，每次改變1 個(gè)因素條件，研究固液比即不同量凝脂蓮莖稈干料與水的比例（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 W/W）、提取時(shí)間（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、浸泡時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、和微波提取功率（100、200、400、600、800 W）對(duì)凝脂蓮莖稈香精提取率的影響。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察，固液比發(fā)生變化會(huì)影響微波功率下微波集中吸收量，改變香精的提取率，兩者互相影響，不可同時(shí)改變，故以固液比為1∶8，凝脂蓮莖稈香精得率為考察指標(biāo)，選擇浸泡時(shí)間、微波功率和提取時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表4、表5。

表1 微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮莖稈香精的水平因素Tab.1 Level factors of extracting essential oil from stem of S. clavatum by microwave-assisted hydro-distillation (MAHD)

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片與莖稈香精提取率

由表2 可知，凝脂蓮葉片與莖稈的香精提取率相對(duì)比，莖稈的香精提取率要遠(yuǎn)高于葉片，但是莖稈的香精提取時(shí)間大約為葉片香精提取時(shí)間的兩倍，耗時(shí)差異較大可能是因?yàn)榍o稈處細(xì)胞間隙較大，組織細(xì)胞充分膨脹裂開時(shí)間較久。

表2 微波輔助水蒸氣法對(duì)凝脂蓮葉片與莖稈香精的提取率Tab. 2 Yield of essential oil from leaves and stems of S. clavatum by MAHD

2.2 植株、葉片、莖稈香精成分分析

在上述色譜與質(zhì)譜條件下，得到凝脂蓮植株、莖稈、葉片香精氣相色譜-質(zhì)譜總離子流量圖，如圖1。共檢測(cè)出39 種主要化學(xué)成分，凝脂蓮香精組分分析鑒定結(jié)果見表3。由圖1、表3 可得，從凝脂蓮植株香精揮發(fā)物中共鑒定出17 種主要化學(xué)物質(zhì)，其中烯烴類7 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的39.58%；酸類3 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的11.18%，脂類2 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的6.63%。主要揮發(fā)物成分及占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)比例是1R-α-蒎烯（15.50%）、(+)-α-長(zhǎng)葉蒎烯（10.82%）、檸檬烯（8.95%）、軟脂酸（6.27%）、9,12-十八碳二烯酸丁酯（3.92%）、3,5-二叔丁基-4-羥基苯基丙酸（3.76%）。從凝脂蓮莖稈所提取的香精揮發(fā)物中鑒定出14 種化學(xué)物質(zhì)，其中烯烴類3 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的5.45%；醇類3 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的36.94%，無醛類。主要揮發(fā)物成分及占總揮發(fā)物質(zhì)比例是桉葉油醇（31.40%）、2,4-二叔丁基苯酚（12.04%）、皮蠅磷（7.88%）、異辛烷（6.04%）。從凝脂蓮葉片所提取的香精揮發(fā)物中鑒定出8 種化學(xué)物質(zhì)，其中酮類2 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的3.95%；醇類1 種，占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)的10.15%，無烯烴類。主要揮發(fā)物成分及占總揮發(fā)物質(zhì)種數(shù)比例是2,4-二叔丁基苯酚（28.38%）、4-萜烯醇（10.15%）、2,6-二羥基苯乙酮，雙（三甲基甲硅烷基）醚（8.95%）、油酸腈（6.18%）。

圖1 凝脂蓮香精氣相色譜-質(zhì)譜總離子流量圖Fig. 1 GC-MS total ion current of volatile aromatic compounds from S. clavatum essential oil

表3 凝脂蓮香精組分分析（主要成分）Tab. 3 Components of essential oil of S, clavatum

2.3 單因素對(duì)凝脂蓮莖稈香精提取率的影響

2.3.1 固液比對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響 研究凝脂蓮莖稈干樣與水的各種比例對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響，結(jié)果如圖2。由圖2 可知，不同固液比對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響比較明顯，隨著水量的增加，提取率增加，這是因?yàn)楦嗟臉O性水滲入植物器官與腺體，當(dāng)傳輸系統(tǒng)中存在極性分子相互作用時(shí)，導(dǎo)致局部過熱，更多的極性水會(huì)使植物體內(nèi)的壓力梯度增加，細(xì)胞壁破裂，導(dǎo)致香精成分更容易被釋放到溶液中去。當(dāng)固液比在1∶8 時(shí)，莖稈的香精提取率最高，隨著水的比例持續(xù)增加，香精在水中的溶解度增大導(dǎo)致水介質(zhì)中香精含量損失[20]，香精提取率降低。

圖2 不同固液比對(duì)香精提取率的影響Fig. 2 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of essential oil

2.3.2 浸泡時(shí)間對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響 浸泡時(shí)間對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，浸泡時(shí)間從60 min 到150 min 之間，香精提取率相對(duì)穩(wěn)定，其中，浸泡時(shí)間為60 min 時(shí)，香精提取率相對(duì)較高，浸泡60 min 后，香精提取率下降，在120 min 到150 min 之間時(shí)，香精提取率又上升，但未超越浸泡60 min 時(shí)的香精提取率，因此，確定最佳浸泡時(shí)間為60 min。

圖3 不同浸泡時(shí)間對(duì)香精提取率的影響Fig. 3 Effect of different soaking time on the extraction rate of essential oil

2.3.3 微波功率對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響 微波功率對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，揮發(fā)性香精的提取率會(huì)隨著微波功率的增加而增加，這是由于在較高的微波功率下，微波能集中被水吸收，從而提高了凝脂蓮揮發(fā)性香精的釋放率，當(dāng)微波功率超過400 W 時(shí)，更高的功率會(huì)使整個(gè)傳輸系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生相互碰撞，減少了香精的組分，因此微波最佳功率為400 W。

圖4 不同微波功率對(duì)香精提取率的影響Fig. 4 Effect of different microwave powers on extraction rate of essential oil

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)凝脂蓮香精提取率的影響，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可以看出，隨著時(shí)間的增加，凝脂蓮揮發(fā)性香精的提取率不斷增加。因?yàn)樘崛r(shí)間增加植物細(xì)胞間隙增大，組織細(xì)胞充分膨脹，使細(xì)胞內(nèi)、外液交換速度更快，有利于香精提取率的提高。在提取時(shí)間為3 h 時(shí)香精提取率達(dá)到頂峰，但提取3 h 之后，隨著香精在水中的溶解，精油提取率降低。綜合考慮，最佳提取時(shí)間為3 h。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)香精提取率的影響Fig. 5 Effect of different extraction time on the extraction rate of essential oil

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4、表5 可知，微波輔助水蒸氣法提取凝脂蓮莖稈香精的各因素中，微波功率影響最大，其次是提取時(shí)間，浸泡時(shí)間影響最小，但三者影響均無顯著性。最佳提取工藝是A1B2C3，即浸泡時(shí)間60 min、微波功率400 W、提取時(shí)間3 h，固液比1∶8。

表4 微波輔助水蒸氣法提取莖稈香精正交試驗(yàn)的結(jié)果Tab. 4 Result of orthogonal experiment on extraction of essential oil from stem by MAHD

表5 方差分析結(jié)果Tab. 5 ANOVA result

3 討論與結(jié)論

本研究采用GC-MS 測(cè)定發(fā)現(xiàn)凝脂蓮莖稈香精與植株香精重復(fù)成分為2 種，分別是1R-α-蒎烯、石竹烯，在原植株揮發(fā)物總種數(shù)中占比分別為15.60%、1.31%。而葉片所提取的香精與植株香精無重復(fù)成分。將兩者對(duì)比，莖稈香精在重復(fù)成分以及香精的含量上都要高于葉片香精。凝脂蓮莖稈香精成分中含有大量的醇類及烯烴類化合物，相對(duì)于王利國等[21]采用GC-MS 檢測(cè)梔子Gardeniajasminoides花香精化學(xué)成分主要有酯類、萜烯類、烴類化合物；劉更濤[22]采用GC-MS 檢測(cè)牡丹Paeoniasuffruticosa香精化學(xué)成分主要有醛類及醇類化合物。上述報(bào)道中有關(guān)凝脂蓮香精成分與其他植物香精成分差異較大，推測(cè)主要原因可能與植物本身特性以及各自的提取方法有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究闡明。

本研究中使用凝脂蓮莖稈來提取香精效果要遠(yuǎn)高于葉片提取香精效果。原因有以下幾個(gè)方面：第一，葉片香精提取率遠(yuǎn)低于莖稈香精提取率，大約只有莖稈香精提取率的1/4；第二，由于其葉片為肉質(zhì)結(jié)構(gòu)，在干燥烘干過程中一旦沒有事先切出小口容易發(fā)生爆裂，而莖稈干燥烘干則無爆裂危險(xiǎn)。遂在單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)中只考慮對(duì)莖稈香精的提取率影響。由單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)可知，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，在固液比1∶8、浸泡時(shí)間60 min、微波功率400 W、提取時(shí)間3 h 的條件下，凝脂蓮香精提取率最高，平均提取率達(dá)到了0.96%，在現(xiàn)實(shí)產(chǎn)業(yè)化過程中，此數(shù)據(jù)可供參考。通過實(shí)驗(yàn)研究我們可以得到，無論是在提取率還是在香精成分研究上都是使用莖稈來提取為優(yōu)。再加上實(shí)際中，凝脂蓮由于其葉片厚實(shí)，莖稈香精含量高[23]，大多使用葉片“葉插”繁殖，且春秋為凝脂蓮的生長(zhǎng)季，所以在實(shí)際產(chǎn)業(yè)化時(shí)，可以采用“春秋葉片扦插，冬夏莖稈提取”的輪作型產(chǎn)業(yè)方式。對(duì)凝脂蓮的香精成分分析旨在通過對(duì)其揮發(fā)物成分進(jìn)行定性和定量分析[24]，同時(shí)為今后對(duì)凝脂蓮的其他科學(xué)研究提供參考價(jià)值。