CARD蛋白家族在缺血性卒中中的研究進(jìn)展

胡玉潔綜述， 徐運(yùn)審校

卒中是全球的第二大死因，也是導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的主要原因。87%的卒中是缺血性卒中，每年全球約有80萬(wàn)人罹患缺血性卒中［1］。腦血流的突然中斷導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭并迅速死亡，繼發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損傷。缺血性卒中的病理生理機(jī)制涉及興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等過(guò)程。CARD是由約90個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡、炎癥和先天細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用［2］。近年來(lái)，CARD蛋白家族已被廣泛證明與缺血性卒中相關(guān)。CARD蛋白家族通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡，從而直接或間接地影響缺血性卒中的發(fā)展和預(yù)后。本文就CARD蛋白家族調(diào)控缺血性卒中進(jìn)行歸納和分析，進(jìn)一步闡述CARD蛋白的作用機(jī)制，為今后探究CARD蛋白在缺血性卒中中的臨床轉(zhuǎn)化提供潛在靶點(diǎn)和研究基礎(chǔ)。

1 CARD家族概述

CARD家族屬于死亡結(jié)構(gòu)域超家族，以包含一個(gè)6個(gè)或7個(gè)反平行α螺旋束的結(jié)構(gòu)為特征［3］。CARD能夠通過(guò)同型相互作用和與含CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用促進(jìn)大型寡聚信號(hào)復(fù)合物的組裝。根據(jù)整體結(jié)構(gòu)域的區(qū)別可以將CARD蛋白分為四個(gè)亞家族：（1）核苷酸結(jié)合域（nucleotide-binding domian，NBD）-CARDs：Apaf-1、NOD1、NOD2、CARD7、CARD12；（2）coiled-coil-CARDs：CARD9、CARD11（CARMA1）、CARD14（CARMA2）、CARD10（CARMA3）；（3）bipartite-CARDs：RIPK2（CARD3）、Bcl10、CARDD、PYCARD/ASC、ARC、半胱天冬酶（Caspase）-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、CARD8；（4）CARD-only proteins（COPs）：PSEUDO-ICE/CARD18、ICEBERG/CARD16［4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CARD與多種腫瘤、心血管疾病（高血壓、心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化）、自身免疫性疾病（強(qiáng)直性脊柱炎）、炎癥性疾病（克羅恩病）、皮膚病（銀屑病、特異性皮炎、真菌感染性疾病）相關(guān)，提示其在多種病理生理過(guò)程中具有重要作用［5-7］。

2 NBD-CARDs與缺血性卒中

2.1 Apaf-1 細(xì)胞凋亡激活因子-1（Apaf-1）是細(xì)胞應(yīng)激或損傷的傳感器，也是細(xì)胞凋亡線粒體通路中激活Caspase的關(guān)鍵分子［8］。在細(xì)胞凋亡期間，Apaf-1通過(guò)CARD-CARD相互作用促進(jìn)Caspase-9活化，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Apaf-1在腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠中顯著升高［9］。Apaf-1相互作用蛋白AIP是Caspase-9的新型短變體，包含CARD結(jié)構(gòu)域，但缺乏Caspase-9所具有的催化結(jié)構(gòu)域。小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)AIP可以有效抑制MCAO后的細(xì)胞凋亡，提示靶向Apaf-1-Caspase-9信號(hào)通路可能是一種可行的缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)策略［10］。

2.2 NOD1、NOD2 先天免疫依賴于跨膜Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體（NOD-like receptors，NLR）來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。核酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域1（NOD1）是NLR家族的成員。NOD1在MCAO小鼠海馬中顯著上調(diào)，NOD1配體DAP顯著增加MCAO小鼠自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3BII的表達(dá)，激活NF-κB通路，擴(kuò)大梗死體積并加重神經(jīng)功能缺損［11］。NOD2在體外氧糖剝奪的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中升高，通過(guò)NOD2/MAPK/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥［12］。研究表明，NOD2參與腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)，NOD2基因敲除能改善缺血性卒中的預(yù)后［13］。因此，NOD1/2是減輕缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。

3 coiled-coil-CARDs 與缺血性卒中

3.1 CARD9 在多種細(xì)胞，特別是免疫細(xì)胞中表達(dá)，參與先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，與感染、炎癥、腫瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病相關(guān)。CARD9是Bcl-10和NF-κB、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的上游激活劑，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［14］。在MCAO小鼠中，骨髓細(xì)胞上表達(dá)的TREM-1可以通過(guò)與SYK相互作用來(lái)激活下游促炎途徑CARD9/NF-κB和NLRP3/Caspase-1［15］。CARD9在缺血性卒中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.2 CARMA CARD10、CARD11、CARD14都屬于CARMA蛋白［16］。在一項(xiàng)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的研究中，CARD11被鑒定為缺血性卒中的免疫相關(guān)遺傳生物標(biāo)志物［17］。

黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1（mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT1），是一種參與NF-κB信號(hào)通路的多功能蛋白。MALT1在調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)的大量基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用。MALT1能夠調(diào)節(jié)先天性自然殺傷細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）中促炎基因的表達(dá)［18］。MALT1與Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子呈正相關(guān)，也與急性缺血性卒中的疾病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)［19］。

4種coiled-coil-CARDs都可以與Bcl10和MALT1形成CBM（CARD-Bcl10-MALT1）復(fù)合物。CBM復(fù)合物是一種控制免疫和炎癥通路的多蛋白信號(hào)平臺(tái)，調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK信號(hào)通路（A20、HOIL1、CYLD、RELB）和mRNA結(jié)合蛋白（regnase1、roquin1、roquin2）的降解，在免疫缺陷疾病、炎癥性疾病和免疫系統(tǒng)癌癥中發(fā)揮重要作用［16］。CBM復(fù)合物參與DNA損傷誘導(dǎo)的NF-κB活化，并阻止細(xì)胞凋亡［20］。研究發(fā)現(xiàn)，A20可以通過(guò)去泛素化RIPK3發(fā)揮抗壞死作用，然而在缺血性卒中的大鼠模型中MALT1通過(guò)增強(qiáng)A20的降解來(lái)促進(jìn)大腦的壞死［21］。目前CARMA和CBM復(fù)合物在缺血性卒中中的研究較少，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 bipartite-CARDs與缺血性卒中

4.1 RIPK2/CARD3 受體相互作用蛋白2（RIPK2/CARD3）是NOD2下游的信號(hào)銜接蛋白，增強(qiáng)IKKγ/NF-κB必需修飾物（NEMO）的泛素化。CARD3水平在小鼠大腦缺血再灌注損傷后的腦組織中以時(shí)間依賴性方式顯著上調(diào)。敲除CARD3能減少梗死體積，改善神經(jīng)病理學(xué)評(píng)分，減輕炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡；而神經(jīng)元特異性的CARD3過(guò)表達(dá)擴(kuò)大了腦梗死體積，加重了神經(jīng)功能缺損并且增強(qiáng)缺血性卒中后的炎癥反應(yīng)。MAPKs家族成員，如JNK、ERK和p38在缺血性卒中后迅速被激活。值得注意的是，再灌注6 h后，磷酸化的JNK和p38在CARD3敲除小鼠中明顯降低，但在神經(jīng)元特異性CARD3過(guò)表達(dá)的小鼠中顯著升高，兩種情況中p-ERK都沒(méi)有明顯變化，這提示CARD3可能通過(guò)MAPK通路加重缺血再灌注損傷。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1（TAK1）被廣泛認(rèn)為是3種傳統(tǒng)MAPKs通路的共同調(diào)節(jié)因子，神經(jīng)元特異性CARD3過(guò)表達(dá)小鼠MCAO后TAK1的激活顯著增強(qiáng)，而在CARD3敲除小鼠中則降低。TAK1特異性抑制劑顯著減少了神經(jīng)元特異性CARD3過(guò)表達(dá)小鼠MCAO后的梗死體積，減輕了缺血相關(guān)的炎癥和細(xì)胞凋亡［22］。CARD3不僅可以調(diào)節(jié)炎癥還可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元凋亡誘導(dǎo)缺血再灌注損傷，提示靶向CARD3具有緩解缺血性卒中的潛力，能否開(kāi)發(fā)一種跨血腦屏障的CARD3拮抗劑仍有待進(jìn)一步研究。

4.2 PYCARD PYCARD是炎癥小體的重要組成成分，包含N端Pyrin結(jié)構(gòu)域（PYD）和C端CARD結(jié)構(gòu)域。PYCARD與活化的NLRP3寡聚體中的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并通過(guò)PYD-PYD同源型結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源寡聚體纖維，進(jìn)一步聚集形成PYCARD寡聚體和大的PYCARD斑點(diǎn)，招募并激活pro-Caspase-1，維持長(zhǎng)時(shí)間的炎癥小體激活［23］。PYCARD寡聚體可以被釋放到細(xì)胞間隙，被鄰近的炎性細(xì)胞吸收以維持持續(xù)的免疫反應(yīng)。He等［24］研究發(fā)現(xiàn)，重組PYCARD激活NLRP3，誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，惡化了復(fù)發(fā)性缺血性卒中的結(jié)局。

4.3 CARD8 CARD8作為一種銜接分子，負(fù)調(diào)控Caspase-1依賴性IL-1β的產(chǎn)生，并抑制NF-κB的激活［25］。CARD8編碼C10X變異體外顯子5的無(wú)意義T30A多形現(xiàn)象（rs2043211）與中國(guó)人群大動(dòng)脈粥樣硬化卒中相關(guān)。Gu等［26］研究了中國(guó)人群中CARD8在大動(dòng)脈粥樣硬化卒中患者中的表達(dá)和rs2043211的影響。結(jié)果表明，rs2043211變異純合子T/T與左心耳卒中風(fēng)險(xiǎn)顯著增加相關(guān)，具有T/T基因型的高血壓患者發(fā)生左心耳卒中的風(fēng)險(xiǎn)更高，風(fēng)險(xiǎn)等位基因T使CARD8表達(dá)增加，提示rs2043211可能是中國(guó)人大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中的一種新型生物標(biāo)志物。Bai等［27］研究發(fā)現(xiàn)，9p21位點(diǎn)上的非編碼RNA ANRIL可能通過(guò)調(diào)節(jié)CARD8通路增加缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)。CARD8在缺血性卒中發(fā)病機(jī)制中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

4.4 免疫信號(hào)適配器（Bcl10） Bcl10最初是在黏膜相關(guān)淋巴組織的B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的染色體易位t（1； 14）（p22； q32）附近的候選基因，是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白［28］。Bcl10收到刺激信號(hào)后形成細(xì)絲并聚集成介導(dǎo)和傳遞信號(hào)的高級(jí)簇，最終激活MALT1并傳導(dǎo)NF-κB和JNK信號(hào)。Bcl10在大鼠皮質(zhì)局灶性光栓4 h后的缺血半暗帶區(qū)表達(dá)升高了60%［29］。在一項(xiàng)基于多加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）和單細(xì)胞分析的研究中Bcl10被鑒定為缺血性卒中相關(guān)的關(guān)鍵基因［30］。Bcl10在缺血性卒中中的研究較少，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4.5 Caspase Caspase家族在程序性死亡和炎癥中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、Caspase-12包含CARD結(jié)構(gòu)域。Caspase根據(jù)其功能分為凋亡型和炎癥型。凋亡型Caspase可進(jìn)一步分為啟動(dòng)型和效應(yīng)型。Caspase-2、Caspase-9屬于啟動(dòng)型，作為蛋白水解信號(hào)放大器激活效應(yīng)型Caspase。Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12屬于炎癥型，激活細(xì)胞焦亡，觸發(fā)DAMPs的激活和分泌以促進(jìn)炎癥［31］。

缺血性卒中后Caspase的表達(dá)受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在大鼠MCAO造模12 h后Caspase-2則維持相對(duì)穩(wěn)定的水平［32］。Caspase-2基因敲除并不影響永久性局灶性缺血后的神經(jīng)功能缺損和組織損傷，在小鼠短暫性和永久性動(dòng)脈閉塞后pro-Caspase-2的量保持不變，表明Caspase-2不是腦缺血導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要效應(yīng)物［33］。然而，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠MCAO和小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a的氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型中Caspase-2蛋白表達(dá)升高［34］。這可能與造模條件有關(guān)，也提示Caspase-2經(jīng)歷復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

Caspase-1被NLRP3/PYCARD激活后可以引發(fā)細(xì)胞焦亡。抑制Caspase-1可MCAO以通過(guò)抑制焦亡和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)/MAPK通路顯著改善大鼠缺血性卒中后血腦屏障的通透性和完整性［35］。

Caspase-4通過(guò)激活非規(guī)范的炎癥小體、NLRP3炎癥小體以及與TRAF6-IRAK1（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6-IL-1R-associated kinase 1）復(fù)合物的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞焦亡、IL-1β的活化和分泌以及NF-κB炎癥通路［36］。

在大鼠MCAO模型中，Caspase-9在再灌注1 h就已經(jīng)被激活，神經(jīng)元活化的Caspase-9激活Caspase-6介導(dǎo)缺血性卒中后12 h內(nèi)的軸突丟失和24 h內(nèi)的神經(jīng)元死亡，在再灌注后4 h通過(guò)鼻內(nèi)遞送一種新型細(xì)胞膜穿透的高特異性Caspase-9抑制劑可以在缺血后3周持續(xù)提供神經(jīng)保護(hù)作用［37］。研究發(fā)現(xiàn)多種中藥復(fù)方和中草藥提取物，如木香油方、大黃堿、冬凌草素，可以改善Caspase-9介導(dǎo)的缺血性卒中后的細(xì)胞凋亡［38-40］。

Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的核心參與者。激活的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位到胞質(zhì)，直接裂解Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3［41］。Mouw等［42］研究發(fā)現(xiàn)Caspase-12在MCAO后的紋狀體和大腦皮質(zhì)中顯著升高。重組IL-17A還可以通過(guò)Caspase-12依賴性途徑加劇缺血性卒中小鼠的神經(jīng)元凋亡［43］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪（OGD）處理后出現(xiàn)細(xì)胞損傷和凋亡的增加，Caspase-12、裂解的Caspase-3、NLRP3炎癥小體成分和IL-1β的蛋白水平也顯著升高；使用Caspase-12特異性抑制劑ZATAD-FMK預(yù)處理可以保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免受OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并抑制NLRP3炎癥小體的激活［41］。Caspase-12及其對(duì)NLRP3炎癥小體激活的調(diào)節(jié)可能是治療缺血性卒中的潛在靶點(diǎn)，具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

5 CARD-only proteins

COPs是Caspase-1和炎癥小體NLR家族激活的調(diào)節(jié)因子［44］。CARD18與含有CARD的激酶RICK/RIP2/CARDIAK相互作用并激活NF-κB［45］。CARD16、CARD17和CARD18通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并取代Caspase-1蛋白之間的CARD相互作用，改善尿酸晶體介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化和炎癥性疾病［46］。研究發(fā)現(xiàn)抑制ICE可以減少缺血性和興奮性毒性神經(jīng)元損傷［47］。ICE突變能夠改善缺血誘導(dǎo)的腦損傷程度并保留神經(jīng)功能［48］。COPs在缺血性卒中中的作用有待進(jìn)一步研究。

6 其他CARD

CARD6是NF-κB活化的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)協(xié)同RIPK家族調(diào)節(jié)NF-κB的活化［49］。在一項(xiàng)基于WGCNA和機(jī)器學(xué)習(xí)鑒定缺血性卒中患者外周血中的免疫相關(guān)關(guān)鍵基因的研究中，CARD6被認(rèn)為是缺血性卒中相關(guān)的樞紐基因。CARD6與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，與幼稚B細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)［50］。

7 小結(jié)

CARD蛋白家族參與細(xì)胞炎癥和凋亡，在缺血性卒中的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)蛋白的突變也與缺血性卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。目前有關(guān)CARD蛋白家族在腦缺血中的研究不斷出現(xiàn)，為靶向相關(guān)通路的治療提供基礎(chǔ)。本文歸納CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究（見(jiàn)表1）。目前，CARD蛋白家族的研究主要關(guān)注MAPK和NF-κB等信號(hào)通路，我們希望能更進(jìn)一步地研究CARD蛋白家族各個(gè)成員的功能和具體的調(diào)控機(jī)制，為臨床轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)新的策略和藥物靶點(diǎn)提供可能性。

表1 CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡玉潔負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集、撰寫論文，徐運(yùn)負(fù)責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。