香芹酚輔助慶大霉素殺滅銅綠假單胞菌

摘要：銅綠假單胞菌是一種能引起禽類、畜類多種疾病的多重耐藥菌，其外膜通透性遠低于其他桿菌科細菌，是造成其耐藥性和臨床治療失敗的重要原因。通過測試不同濃度的香芹酚與慶大霉素在不同處理條件（包括濃度、時間及介質）下，對銅綠假單胞菌的殺傷作用，并評估對銅綠假單胞菌細胞膜破壞的程度，進一步探究香芹酚作為佐劑輔助慶大霉素對銅綠假單胞菌PAO1的殺傷作用。結果表明：在0.01%香芹酚的輔助下，慶大霉素的用量可降低百倍，在1 h內即可顯著增強對銅綠假單胞菌的殺菌效果。輔助效果于不同介質中具有適應性，在不同抗生素下也具有一定的廣譜性，并且能夠提高慶大霉素對臨床銅綠假單胞菌殺傷效果。研究結果為香芹酚作為抗菌佐劑在降低銅綠假單胞菌耐藥性方面的應用提供了有力的數據支持。

關鍵詞：細菌耐藥；銅綠假單胞菌；佐劑；香芹酚；輔助

中圖分類號：S855.1文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）12?0053?07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.12.009

Analysis on the Effect of Carvacrol-assisted Gentamicin on Killing Pseudomonas aeruginosa

WANG Yu-chan，CHEN Jia-jun，CHEN Dan-yan，LIU Jun-hui，WANG Yan*

（Fujian Provincial University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation，College of Life Science，Fujian Normal University，Fuzhou，Fujian 350108，China）

Abstract：Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant bacterium that can cause a variety of diseases in poultry and livestock，and its outer membrane permeability is much lower than that of other bacillaceae，which is an important reason for its drug resistance and clinical treatment failure.By testing the killing effect of different concentrations of carvacroland gentamicin on Pseudomonas aeruginosa under different treatment conditions（including concentration，time and medium），the degree of damage to the cell membrane of Pseudomonas aeruginosa was evaluated，and the killing effect of carvacrol as an adjuvant on gentamicin against Pseudomonas aeruginosa PAO1 was further explored.The results showed that with the assistance of 0.01%carvacrol，the dosage of gentamicin could be reduced by 100 times，and the bactericidal effect on Pseudomonas aeruginosa could be significantly enhanced within 1 hour.The auxiliary effect was adaptable to different media，and also had a certain broad-spectrum activity under different antibiotics，and could improve the killing effect of gentamicin on the clinical Pseudomonas aeruginosa.The results of this study provided strong data support for the application of carvacrol as an antimicrobial adjuvant in reducing the drug resistance of Pseudomonas aeruginosa.

Key words：Bacterial resistance；Pseudomonas aeruginosa；Adjuvants；Carvacrol；Auxiliary

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），廣泛存在于養殖場的土壤、水體和動物宿主體內等不同環境中，具有易定植、易變異和多重耐藥的特點，是一種常見的人獸共患的條件致病菌[1]。因其能產生胞外酶、內毒素、外毒素A等10余種致病因子[2]，且自身外膜通透性遠低于其他腸桿菌科細菌，許多抗菌劑難以穿過外膜對其造成傷害，導致其具有感染性強、耐藥率高的特點[3?4]。在我國，銅綠假單胞菌常能夠引起雞[5]、鹿[6]、水貂[7]、林麝[8]等禽類、畜類的各種急慢性感染，包括眼膜炎、鼻竇炎、出血性肺炎、泌尿道感染等，可進一步惡化為致死性腹瀉、菌血癥和敗血癥等疾病，對動物健康構成極大威脅，同時嚴重影響養殖場的經濟效益。目前，隨著社會經濟的發展，養殖業規模的不斷擴大，由銅綠假單胞菌引起的疫病正呈不斷上升的趨勢，不僅給動物生產行業造成巨大的經濟損失，并對公共衛生造成嚴重的影響[9]。因此，迫切需要一種新策略來有效防治銅綠假單胞菌。

香芹酚（Carvacrol）是一種液體單萜酚，外觀為淡黃色或無色的黏稠油狀液體，是牛至、百里香等植物精油中的主要成分[10]。香芹酚分子量小，脂溶性高，因其結構中含有酚羥基，而具有一定的親水性，易透過細菌細胞膜發揮作用[11]。香芹酚在日常生活中應用廣泛，常被用作調味劑、防腐劑、驅蟲劑以及化妝品配方中重要的香料成分。眾多研究表明，香芹酚可作為食品添加劑使用，并已被證實可以安全食用[12]。目前，香芹酚已被美國聯邦藥物管理局（FDA）列為公認安全的食品成分[13]。此外，香芹酚還具有許多藥理學特性，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎、保肝、解痙和血管松弛等，擁有廣泛的應用前景[14]。

由于養殖中過度使用抗生素以抵抗病原菌，導致病原菌逐漸對抗生素失去敏感并產生耐藥性，使得許多常見抗生素的殺菌效果正逐漸減弱。本研究旨在利用銅綠假單胞菌自身外膜通透性低的特性，采用對細菌細胞膜具有活性的香芹酚作為抗生素的增效佐劑，以提高抗生素的殺傷效果，為抗生素增效殺菌提供新方法，并為有效降低病原菌產生耐藥性的風險提供新的策略。

1材料與方法

1.1試驗材料

銅綠假單胞菌PAO1，由細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室保藏。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器小型離心機（Sigma1-14）、恒溫培養箱（旻泉MQL-61R）、恒溫搖床（旻泉儀器）、渦旋振蕩儀（Vortex QL-861）、掃描儀（Epson J232D）、熒光顯微鏡（Nikon MODEL ECLPSE Ci-L plus）。

1.2.2主要試劑試驗所需抗生素及工作濃度如下：（1）氨基糖苷類抗生素：10μg·mL?1妥布霉素（Tobramycin，Tob）、10μg·mL?1慶大霉素（Gen-tamicin，Genta）、10μg·mL?1鏈霉素（streptomy-cin，Strep）、10μg·mL?1卡那霉素（Kanamycin，Kana）。（2）β-內酰胺類抗生素：100μg·mL?1氨芐西林（Ampicillin，Amp）、100μg·mL?1美羅培南（Meropenem，Mer）。（3）喹諾酮類抗生素：10μg·mL?1氧氟沙星（Ofloxacin，Ofl）、10μg·mL?1環丙沙星（Ciprofloxacin，Cip）。其他試劑：香芹酚（純度＞98%）；DMSO（二甲基亞砜）；雙蒸水；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）；Tris-蔗糖溶液；生理鹽水；LB培養基；MHB培養基；碘化丙啶（propidium iodine，PI）。

1.3試驗方法

1.3.1銅綠假單胞菌菌種活化及稀釋點板方法菌種活化：蘸取凍存于-80℃的銅綠假單胞菌菌液，加至1 mL LB液體培養基中，置于220 r·min?1、37℃搖床過夜培養進行活化，所得菌液1∶500轉接于LB液體培養基中，于220 r·min?1、37℃搖床培養22 h，即得平臺期銅綠假單胞菌菌液。

稀釋點板：經不同試驗處理后取樣100μL的菌液進行13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，而后用等量PBS緩沖液重懸菌體，重復洗滌2次，每次靜置5 min，最終用等量PBS進行重懸作為母液。所獲母液以10倍的梯度用PBS緩沖液稀釋，稀釋梯度為10、102、103、104、105，每個稀釋度取4μL菌液點在LB固體培養基平板上，倒置于37°C恒溫培養箱20 h后，掃描平板記錄數據，進行計數，計算銅綠假單胞菌經處理后的存活率。

殺菌測試試驗的菌液活化、洗脫、點板均與上述方法相同，僅是處理時的抗生素類型、濃度，香芹酚的濃度及處理時間、介質不同。

1.3.2不同濃度香芹酚輔助慶大霉素殺滅平臺期銅綠假單胞菌的濃度梯度測試取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，于13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組（不加香芹酚不加抗生素）。準備11根搖菌管，分別吸取300μL菌液分裝于無菌玻璃搖菌管中，編號為1～11。1號管為慶大霉素（10μg·mL?1）單處理組。2～6號管為香芹酚單處理組，分別設置香芹酚濃度梯度為0.002 5%、0.005%、0.01%、0.02%、0.05%。7～11號管分別在添加以上濃度香芹酚的濃度后，于每管中添加相同濃度的慶大霉素（10μg·mL?1）作為雙處理組。蓋上搖菌管塞，將上述11個搖菌管置于220 r·min?1、37℃搖床孵育5h處理。

1.3.3香芹酚輔助不同濃度慶大霉素殺滅平臺期銅綠假單胞菌濃度梯度測試取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，于13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組。再分別吸取300μL菌液分裝于11個無菌玻璃搖菌管中，編號為1～11。1號管中加入0.01%香芹酚作為香芹酚單處理組，2～6號管內分別加入慶大霉素0.1、1、10、50、100μg·mL?1作為抗生素單處理組，7～11號管分別按序加入上述5種濃度的慶大霉素，并分別加入0.01%香芹酚作為雙處理組，最后將上述11個搖菌管均置于220 r·min?1、37℃搖床孵育5 h處理。

1.3.4香芹酚輔助慶大霉素于不同時間下殺滅平臺期銅綠假單胞菌時間梯度測試取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，于13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組。再分別吸取700μL菌液分裝于3個無菌玻璃搖菌管中，設置0.01%香芹酚單處理組、慶大霉素（10μg·mL?1）單處理組以及0.01%香芹酚與慶大霉素（10μg·mL?1）雙處理組。最后將上述3個搖菌管置于220 r·min?1、37℃搖床孵育分別于5 min、1 h、3 h、5 h、7 h時進行取樣清洗以及點板。

1.3.5香芹酚輔助不同殺菌型抗生素殺滅平臺期銅綠假單胞菌效果測試取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，于13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組。再分別吸取300μL菌液分裝于17個無菌玻璃搖菌管中，編號為1～17。1號管中加入0.01%香芹酚作為香芹酚單處理組，2～9號管內分別加入妥布霉素（10μg·mL?1）、慶大霉素（10μg·mL?1）、卡那霉素（10μg·mL?1）、鏈霉素（10μg·mL?1）、環丙沙星（10μg·mL?1）、氧氟沙星（10μg·mL?1）、氨芐西林（100μg·mL?1）、美羅培南（100μg·mL?1）作為抗生素單處理對照，10～17號管分別按序加入上述8種殺菌型抗生素，并分別加入0.01%香芹酚作為雙處理組，將上述17個搖菌管置于220 r·min?1、37℃搖床孵育5 h處理。

1.3.6香芹酚輔助慶大霉素在不同介質中殺滅平臺期銅綠假單胞菌效果測試取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組。再分別吸取300μL菌液分裝于若干個EP管中，13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，分別加入等量的雙蒸水、磷酸緩沖鹽溶液、生理鹽水、Tris-蔗糖、MHB培養基進行重懸。混勻后轉移至無菌玻璃搖菌管，編號為1～10。1～5號管依次為5種不同介質，其內分別加入慶大霉素（10μg·mL?1）作為抗生素單處理對照，6～10號管分別于不同介質之中加入慶大霉素（10μg·mL?1）以及0.01%香芹酚作為雙處理組，將上述10個搖菌管置于220 r·min?1、37℃搖床孵育5 h處理。

1.3.7碘化丙啶染色檢測香芹酚對銅綠假單胞菌外膜破壞取100μL平臺期銅綠假單胞菌PAO1于無菌的EP管中，于13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，加入等量PBS重懸作為未處理組。再分別吸取300μL菌液分裝于3個無菌玻璃搖菌管中，設置0.01%香芹酚單處理組、慶大霉素（10μg·mL?1）單處理組以及0.01%香芹酚與慶大霉素（10μg·mL?1）雙處理組。最后將上述3個搖菌管置于220 r·min?1、37℃搖床孵育3 h后，取樣進行清洗。清洗后使用終濃度為25μg·mL?1碘化丙啶（PI）進行避光孵育15 min，孵育后13 000 r·min?1離心2 min用等量PBS進行清洗，最后5倍濃縮進行重懸，上樣，鏡檢。

1.3.8香芹酚輔助慶大霉素殺滅臨床耐藥銅綠假單胞菌效果測試在臨床收集到的銅綠假單胞菌中隨機選取10株菌分別為PA107、PA112、PA113、PA118、PA122、PA127、PA139、PA701。分別將以上10株菌按1.3.1方法進行活化，1∶500轉接22 h至平臺期。分別取100μL菌液于EP管中，13 000 r·min?1離心2 min，棄上清，分別加入等量PBS作為未處理組。分別吸取300μL于3個玻璃搖菌管中，1號管添加0.01%香芹酚作為香芹酚單處理對照，2號管添加慶大霉素（50μg·mL?1）作為抗生素單處理組，3號管在添加上述等濃度抗生素以及等濃度香芹酚作為雙處理組，最后將搖菌管放置到220 r·min?1、37℃搖床孵育處理5 h。每種臨床銅綠假單胞菌均用上述方法進行處理。

1.4數據處理

試驗數據統計通過GraphPad Prism 8.0.1軟件，ANOVA算法進行顯著性差異分析，數據來源于3次獨立試驗。

2結果與分析

2.1不同濃度香芹酚輔助慶大霉素殺滅平臺期銅綠假單胞菌的濃度梯度測試

由圖1可知，在未添加慶大霉素時，香芹酚單處理在0～0.05%濃度范圍內對平臺期銅綠假單胞菌均無顯著的殺傷作用（P＞0.05）。香芹酚與10μg·mL?1慶大霉素共同處理后，在香芹酚濃度為0～0.005%時，對平臺期銅綠假單胞菌依舊無顯著的殺傷作用（P＞0.05）。而當香芹酚濃度提高至0.01%時，其輔助慶大霉素對銅綠假單胞菌的殺傷效果出現極顯著提高（P＜0.000 1）。因此，后續研究選用0.01%香芹酚為最適濃度進行試驗。

2.2香芹酚輔助不同濃度慶大霉素殺滅平臺期銅綠假單胞菌濃度梯度測試

由圖2可知，處理5 h后，在0.01%香芹酚的輔助下，低濃度的慶大霉素（0.1μg·mL?1）對平臺期銅綠假單胞菌無顯著殺傷效果（P＞0.05）；當慶大霉素濃度提升至1μg·mL?1時，對平臺期銅綠假單胞菌殺傷效果顯著高于慶大霉素單處理（P＜0.05）；當慶大霉素濃度達到10μg·mL?1及以上時，在0.01%香芹酚輔助下，其對銅綠假單胞菌的殺傷效果極顯著高于慶大霉素單獨處理（Plt;0.000 1）。在0.01%香芹酚的輔助下，慶大霉素（1μg·mL?1）與0.01%香芹酚的雙處理殺傷效果比慶大霉素（100μg·mL?1）單處理殺傷效果更強。

2.3香芹酚輔助慶大霉素于不同時間下殺滅平臺期銅綠假單胞菌時間梯度測試

由圖3可知，在7h的處理后，慶大霉素（10μg·mL?1）單處理對銅綠假單胞菌的殺傷效果依舊沒有增強，殺傷效果受到濃度限制。而當加上0.01%香芹酚進行輔助后，雖在短時間5 min內暫未產生輔助效果，但在1h處理后，慶大霉素的殺傷效果極顯著提高（P＜0.000 1）。并且隨著時間的延長，香芹酚的輔助效果逐漸增強。因此，香芹酚輔助慶大霉素殺滅平臺期銅綠假單胞菌具有時間依賴性。

2.4香芹酚輔助不同殺菌型抗生素殺滅平臺期銅綠假單胞菌效果測試

為了探究香芹酚對抗生素輔助效果的廣譜性，分別從3類殺菌型抗生素（氨基糖苷類、β-內酰胺類和喹諾酮類抗生素）中選擇8種抗生素進行輔助殺菌檢測。由圖4可知，在處理5h后，香芹酚在輔助慶大霉素增效殺菌存在極顯著的效果差異（P＜0.000 1），對妥布霉素存在較顯著差異（Plt;0.01），對鏈霉素具有一個數量級的輔助殺菌作用，但于效果分析上無顯著差異（P＞0.05），而對卡那霉素無輔助作用。此外，香芹酚還可以輔助喹諾酮類抗生素殺滅銅綠假單胞菌，在處理5 h后，香芹酚輔助環丙沙星殺滅銅綠假單胞菌的效果具有極顯著的提高（P＜0.000 1），對同為喹諾酮類抗生素的氧氟沙星亦具有較顯著的輔助殺傷效果（P＜0.01）。此外，針對同屬于β-內酰胺類抗生素的氨芐西林和美羅培南，香芹酚均無顯著性輔助殺傷作用（P＞0.05）。可見，香芹酚在輔助不同殺菌型抗生素殺滅銅綠假單胞菌上具有一定的廣譜性，在這3類殺菌型抗生素中，香芹酚輔助氨基糖苷類抗生素的殺菌效果最佳，喹諾酮類次之，β-內酰胺類無效果，這可能是由于不同抗生素的殺菌機制以及抗生素的分子大小差異所致。

2.5香芹酚輔助慶大霉素在不同介質中殺滅平臺期銅綠假單胞菌效果測試

為了探究香芹酚輔助殺傷效果在不同介質中的適應性，本研究以慶大霉素為例進一步測試了香芹酚在不同介質中對殺滅銅綠假單胞菌的輔助效果。由圖5可知，在雙蒸水、MHB以及Tris-蔗糖溶液介質中，香芹酚的輔助效果沒有顯著差異（P＞0.05），而在磷酸緩沖鹽溶液介質中，香芹酚的輔助效果有極顯著的提高（P＜0.000 1）。此外，生理鹽水介質也能極顯著提高（P＜0.001）香芹酚對銅綠假單胞菌的殺傷效果，對于臨床研究具有一定的意義。

2.6碘化丙啶染色檢測香芹酚對銅綠假單胞菌外膜的破壞作用

為了探究香芹酚在輔助慶大霉素殺菌下對細胞外膜的破壞性，本研究在處理后用PI對其進行染色。由圖6可知，在3h處理下，未處理組銅綠假單胞菌保持正常形態，呈現桿狀，染色率低；在0.01%香芹酚單處理下，也能保持正常形態，染色率較未處理組有所提高；在慶大霉素單處理下，銅綠假單胞菌能夠維持正常的桿狀形態，部分菌體于兩端能夠看到明顯的蛋白聚集，相較于香芹酚單處理組染色率有所提高；在雙處理作用下，銅綠假單胞菌依舊可以維持正常桿狀形態，絕大部分菌體兩端均存在蛋白聚集，染色率較慶大霉素單處理有所提高。

2.7香芹酚輔助慶大霉素殺滅臨床耐藥銅綠假單胞菌效果測試

為了驗證香芹酚在臨床方面的應用價值，本研究將隨機從臨床分離出的銅綠假單胞菌中挑選10株進行試驗。由表1可知，在這10株臨床的銅綠假單胞菌中，香芹酚能夠輔助慶大霉素殺滅大多數的臨床銅綠假單胞菌。其中僅對PA112無明顯的增效殺傷，對PA101、PA119、PA125、PA127能夠提高1～2個數量級的殺傷效果。而對PA113、PA118、PA122、PA139、PA701的增強效果非常突出，可提高4～5個數量級。

3討論與結論

20世紀抗生素的發現及其對動物疫病的防治于養殖業而言，無疑是一個重要的舉措[15]。但由于在養殖過程中的過度使用和誤用，不僅使抗生素對動物體的毒副作用增加，甚至還會誘導敏感菌進化成耐藥菌[16]。銅綠假單胞菌作為一種環境適應性廣、感染性強、耐藥率高的條件性致病菌，大量存在于畜禽養殖場的動物體內、土壤、飲用水和工作人員體內，給動物生產造成了較大的危害[17]。耐藥菌的出現使得傳統抗生素在預防和治療動物疾病方面的效果大打折扣，不僅增加了疾病防控的難度，對畜牧業經濟造成不容忽視的影響。同時還給醫療體系帶來較大挑戰，對人們健康構成威脅[17?18]。因此找尋一種可針對銅綠假單胞菌同時適用于養殖行業中的增效減毒的抗生素佐劑迫在眉睫。

根據現有研究顯示香芹酚是安全、可食用的，對人體細胞的毒性小，常被用為食品添加劑[19?20]，2017年已有研究小組將其作為飼料添加劑對多種哺乳動物進行安全性評估，表明在推薦濃度下的香芹酚不會對動物產生安全性影響，并且消費者在食用該動物產品時也不會對身體健康造成傷害[21]。若以優化香芹酚作為封裝形式的多功能食品與醫用抗生素聯合使用，可能能夠更好幫助預防或治療動物和人類疾病。于大型畜禽類給藥而言，口服治療也避免注射等操作難度大的方式，能夠降低一定的經濟成本及人力物力[22]。

本研究通過針對銅綠假單胞菌外膜通透性低的特點，選擇具有能透過細菌外膜生物活性的香芹酚作為抗菌佐劑提高以慶大霉素對銅綠假單胞菌的殺傷效果。由試驗結果證實，0.01%香芹酚的輔助可降低慶大霉素使用量，在一定程度上降低PA的耐藥率以及養殖過程中的成本；于時間上，僅在1 h之內即可對慶大霉素有極顯著的增效殺傷效果，可在一定程度上降低PA的感染效率，提高養殖的存活率，提高經濟效益；不僅如此香芹酚的增效作用還對部分氨基糖苷類抗生素以及喹諾酮類抗生素具有一定的廣譜性；在磷酸緩沖鹽溶液和生理鹽水介質之中具有一定的適應性，并且能夠不同程度提高慶大霉素對臨床銅綠假單胞菌的殺傷效果。以上數據將為開發香芹酚作為抗生素殺菌的增效佐劑提供強有力的支撐。

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（責任編輯：柯文輝）