短乳桿菌SLB1000對Ⅱ型糖尿病大鼠的控糖作用

杜靜婷，藺 楠，施俊鳳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030031）

繼癌癥和心血管疾病之后，糖尿病已成為第三大威脅人類健康的疾病。其中，Ⅱ型糖尿病占糖尿病總發(fā)病率的90%以上[1]。目前的治療手段主要為服用二甲雙胍、噻唑烷二酮類藥物和胰島素注射等[2]。研究表明，添加有益化合物和益生菌的功能性食品也可發(fā)揮重要作用，益生菌可以改善機體腸道菌群豐度、提高機體清除自由基能力、調(diào)節(jié)機體免疫因子，從而緩解糖尿病癥狀[3-5]。許女等[6]從山西老陳醋中篩選到可以降低血糖的植物乳桿菌173，通過調(diào)控與肝臟炎性反應(yīng)、腸道黏蛋白等的相關(guān)基因表達來調(diào)控血糖。張宇等[2]研究表明，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）TD062 可以改善小鼠的Ⅱ型糖尿病癥狀，降低血糖水平和臟器指數(shù)，提高葡萄糖耐受性。Son 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KU15006可抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低血糖指數(shù)。

短乳桿菌通常從發(fā)酵食品、植物和人體腸道中分離而來。研究表明，短乳桿菌對人體多種疾病具有很好的預(yù)防和抑制作用[8]。Noureen 等[9]分離篩選出具有抗氧化作用的短乳桿菌MG000874，可提高D-gal 誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性；Riaz 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌MF179529 可降低單核細胞增生及李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在肝臟、脾臟和腸道中的分化和定殖；Kariyawasam 等[11]研究表明，短乳桿菌KU200019 可以抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）的活性。同樣，某些短乳桿菌亞種也具有輔助降糖作用。Yakovlieva 等[12]發(fā)現(xiàn)，與單純高糖飲食相比，在灌胃短乳桿菌15 d 后，大鼠的血糖上升更加緩慢；Abdelazez 等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌KLDS 1.0727 和短乳桿菌KLDS 1.0373 可顯著降低血糖過高對肝臟、胰腺及腎臟的損害。Li 等[14]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)短乳桿菌YM 1301 發(fā)酵后的黃精，其控制血糖的能力優(yōu)于未發(fā)酵使用黃精。目前，國內(nèi)益生菌株輔助降糖已成為一個新興趨勢，但國內(nèi)有關(guān)短乳桿菌降糖的研究報道較少。本試驗采用的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）SLB1000 由作者分離自山西傳統(tǒng)發(fā)酵醬蘿卜，該菌株降糖效果較為明顯。

肝臟及胰腺細胞受損導(dǎo)致胰島素合成及分泌紊亂是導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病發(fā)生的主要原因，同時氧化應(yīng)激也可能導(dǎo)致胰島細胞受損及外周胰島素抵抗，從而產(chǎn)生高血糖癥狀[11,15]。因此，對患有Ⅱ型糖尿病SD大鼠實施不同劑量的短乳桿菌SLB1000灌胃術(shù)，通過研究其對大鼠體重、臟器指數(shù)、血糖、葡萄糖耐量及抗氧化水平的影響，探討短乳桿菌SLB1000降低大鼠血糖的機制，為短乳桿菌在食品和保健品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

短乳桿菌（Lactobacillus brevis）SLB1000，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），保藏登記號為CGMCC NO.20340，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

SD 大鼠（實驗動物許可證號為SCXK（京）2019-0010），鼠維持飼料和高脂高糖飼料（脂肪供能比為45%，碳水化合物供能比為35%，蛋白質(zhì)供能比為20%），北京斯貝福生物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ），美國Sigma 公司；總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；MRS 培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；10%水合氯醛溶液，福州飛凈生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

金穩(wěn)型血糖測試系統(tǒng)及試紙，三諾生物傳感股份有限公司；BX51 型微分干涉相差顯微鏡，OLYMPUS公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)器，上海科技有限公司；DW-HL340型超低溫冷凍儲存箱，中科美菱低溫科技有限公司；ALLEGRAX-30R型離心機，貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌種的制備

挑取保存于-80 ℃的短乳桿菌SLB1000，劃線接種至MRS 固體培養(yǎng)基中活化，以3%接種量接種至MRS 液體培養(yǎng)基中，32 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃條件下6 000 r/min 離心5 min，沉淀菌體，棄上清，重懸于pH為7.4 的0.9%生理鹽水中，調(diào)整菌體濃度分別為1×108、1×109CFU/mL。

1.2.2 高血糖模型大鼠的建立及分組

健康SD大鼠，雄性，180～200 g，置于飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，除正常組（N）10 只喂食普通維持飼料外，其他大鼠開始喂食高糖高脂飼料，18 d 后即試驗第25 天腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kgmb，以空腹血糖＞7.0 mmol/L作為造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)[1]。

將造模成功的SD 大鼠分成4 組：Ⅱ型糖尿病模型組（M）、短乳桿菌SLB1000低劑量（1×108CFU/mL）組（EL）、短乳桿菌SLB1000 高劑量（1×1010CFU/mL）組（EH）、陽性對照（0.01 g/mL 二甲雙胍）組（P），同時設(shè)置正常組（N），每組10只，按照10 mL/kgmb給予低劑量組和高劑量組SD大鼠灌胃相應(yīng)劑量的短乳桿菌SLB1000，陽性對照組灌胃相同劑量的二甲雙胍溶液，Ⅱ型糖尿病模型組和正常組灌胃相同劑量的生理鹽水，自由飲水飲食，連續(xù)40 d。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 大鼠體重

自購買之日起，每5 d稱量1次體重。

1.2.3.2 大鼠臟器指數(shù)

試驗第75天禁食12 h后稱量SD大鼠空腹體重，解剖SD大鼠取肝臟、腎臟，無菌水沖洗并擦干后稱量臟器質(zhì)量，按下式計算臟器指數(shù)。

式中：mK為殺檢后大鼠的腎臟質(zhì)量，g；mL為殺檢后大鼠的肝臟質(zhì)量，g；m為大鼠質(zhì)量，kg。

1.2.3.3 大鼠血糖值及糖耐量

從開始喂食高脂高糖飼料之日起，每10 d 尾靜脈針刺采血測空腹血糖[16]。灌胃結(jié)束后，禁食過夜，大鼠以2 g/kgmb灌胃葡萄糖溶液后分別于0、0.5、1.0、2.0 h測定血糖值，觀察葡萄糖耐量（OGTT）。

1.2.3.4 血清及肝臟中抗氧化相關(guān)指標(biāo)

動物血液及組織采集和處理[16]：試驗結(jié)束后，SD 試驗大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，解剖SD 大鼠，于腹靜脈針刺采血置于促凝血管中，4 ℃放置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min得血清，于-80 ℃保存，進行血清中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測定。

SD 大鼠血清及肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛含量、總抗氧化能力（T-AOC）均參照相應(yīng)的試劑盒說明進行測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，假定方差齊性，采用LSD 模型對數(shù)據(jù)進行方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 短乳桿菌SLB1000對大鼠體重的影響

由圖1 可以看出，在最初的5～15 d 期間，對照組（N）體重增長均低于其他組。在試驗的第25天時，腹腔注射STZ，10 d 后即試驗第35 天造模成功的SD 大鼠達到56 只，滿足試驗要求。此試驗期間，對照組（N）大鼠體重穩(wěn)步增長，而其他組在試驗35 d后表現(xiàn)出不同程度的體重下降，在45 d 時降至最低。在此期間大鼠排尿量和飲水量大大增加，體型明顯消瘦，推斷為糖尿病引起的體重下降。45 d 時，與模型組（M）相比，高劑量組（EH）和低劑量組（EL）體重分別高12.38%和9.62%。其中模型組（M）體重下降最大，陽性對照二甲雙胍處理組（P）最接近正常體重。短乳桿菌高劑量組（EH）和低劑量組（EL）介于M組與P組之間，表明灌胃短乳桿菌SLB1000在一定程度上可以緩解Ⅱ型糖尿病引起的大鼠體重下降，且灌胃的劑量越大，對體重下降的抑制能力越強。

圖1 短乳桿菌SLB1000對SD大鼠體重的影響Fig.1 Effect of L.brevis SLB1000 on body weight of SD rats

2.2 短乳桿菌SLB1000對大鼠空腹血糖的影響

由圖2可以看出，在試驗第35天時，SD大鼠的空腹血糖值明顯升高，除正常組（N）外，其余4組空腹血糖值均達到15.0 mmol/L 以上，表明造模成功。結(jié)果表明，試驗55 d（造模成功20 d）開始，陽性對照二甲雙胍處理組（P）、短乳桿菌SLB1000的低劑量組（EL）和高劑量組（EH）大鼠的空腹血糖與模型組（M）相比均顯著下降（P＜0.05）。其中，二甲雙胍處理組（P）效果最好，其次是高濃度短乳桿菌處理組（EH），再次是低濃度短乳桿菌處理組（EL）。試驗第55 天時，模型組（M）大鼠的空腹血糖值為19.52 mmol/L，而高劑量組（EH）和低劑量組（EL）的空腹血糖值分別為13.57 mmol/L和15.46 mmol/L，與模型組相比，分別下降了30.48%和20.80%。試驗至75 d 時，除模型組（M）外，其他處理組大鼠的空腹血糖值接近正常組（N）血糖值（5.1 mmol/L），陽性對照組（P）、低劑量組（EL）、高劑量組（EH）分別為6.00、7.68、6.43 mmol/L，說明短乳桿菌SLB1000可有效調(diào)控SD大鼠機體內(nèi)的空腹血糖水平。

圖2 短乳桿菌SLB1000對SD大鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effect of L.brevis SLB1000 on fasting blood glucose of SD rats

2.3 短乳桿菌SLB1000對大鼠口服糖耐量的影響

口服葡萄糖耐量及空腹血糖都是衡量機體血糖調(diào)節(jié)能力的重要指標(biāo)[6,17]。灌胃2 g/kgmb葡萄糖后，分別測定SD 大鼠空腹血糖及0.5、1.0、2.0 h 的血糖，觀察SD大鼠對葡萄糖的代謝能力。

由表1可知，模型組（M）的SD大鼠空腹血糖值顯著高于其他組（P＜0.05），其中正常組（N）血糖最低，低劑量組（EL）空腹血糖值為7.22 mmol/L，略高于正常值，高劑量組（EH）空腹血糖值正常，為6.48 mmol/L，而模型組（M）則為18.94 mmol/L，說明短乳桿菌SLB1000 可有效降低SD 大鼠的空腹血糖值。2.0 h時，高劑量組（EH）、低劑量組（EL）的血糖值分別為20.23 mmol/L 和21.54 mmol/L，仍低于模型組（M），雖然高于正常臨界值（16.7 mmol/L），但與模型組（M）的28.20 mmol/L 相比也顯著下降。說明短乳桿菌SLB1000對血糖調(diào)節(jié)有一定益處，可作為降低血糖濃度的輔助治療手段。

表1 SD大鼠口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果Table 1 Results of oral glucose tolerance test of SD rats單位：mmol/L

2.4 短乳桿菌SLB1000對大鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)為器官或組織的質(zhì)量與體重的比值[18]。當(dāng)臟器發(fā)生病變而導(dǎo)致水腫、肥大、充血時，器官或組織質(zhì)量會發(fā)生變化，從而影響其臟器指數(shù)。5組SD大鼠腎臟指數(shù)和肝臟指數(shù)如圖3所示。正常組（N）大鼠的腎臟指數(shù)為6.5 g/kg，而模型組（M）為10.5 g/kg，經(jīng)過二甲雙胍灌胃后，其數(shù)值降為8.9 g/kg（P組）；而短乳桿菌SLB1000 灌胃后，其高劑量組（EH）和低劑量組（EL）分別為8.4 g/kg和9.2 g/kg，與模型組（M）相比，分別降低了20.95%和12.38%。對于肝臟來說，其模型組（M）的肝臟指數(shù)為42.0 g/kg，二甲雙胍處理組（P）下降了10.24%，而短乳桿菌低劑量組（EL）和高劑量組（EH）分別為35.4 g/kg 和30.4 g/kg，分別降低了15.71%和27.62%，其效果均好于二甲雙胍灌胃處理。由此可見，短乳桿菌SLB1000 對肝、腎臟器病變有抑制緩解作用。

圖3 短乳桿菌SLB1000對SD大鼠臟器指數(shù)的影響Fig.3 Effect of L.brevis SLB1000 on organ index of SD rats

2.5 短乳桿菌SLB1000對抗氧化活性的影響

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶是體內(nèi)的重要酶類，能保護細胞不受過氧化物的損害[19]。大鼠血清抗氧化指標(biāo)見表2。

表2 短乳桿菌SLB1000對SD大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of L.brevis SLB1000 on serum antioxidant index of SD rats

由表2 可以看出，與模型組（M）相比，兩個劑量的短乳桿菌SLB1000 均可提高血清中SOD、GSH-Px和CAT活性，其中高劑量組（EH）較低劑量組（EL）效果更好。高劑量組（EH）大鼠血清中CAT 活性為69.16 U/mL，顯著高于正常組（P＜0.05）。同時試驗發(fā)現(xiàn)，隨著短乳桿菌濃度的升高，大鼠血清中SOD、GSH-Px和CAT三種酶的活性也隨之升高。

機體中不飽和脂肪酸被氧化后會生成MDA，因此，MDA 水平是衡量機體脂質(zhì)過氧化水平的一個重要指標(biāo)。與模型組（M）相比，高劑量組（EH）和低劑量組（EL）SD 大鼠血清中的MDA 含量大大降低，且降低效果明顯優(yōu)于二甲雙胍處理組（P），二甲雙胍處理組為模型組的68.87%，而高劑量組（EH）和低劑量組（EL）SD 大鼠血清中MDA 含量僅為模型組的4.07%和3.88%。本試驗中，正常組（N）與模型組（M）的總抗氧化能力之間差異不顯著，P、EL、EH 組均略高于M 組。綜上得出，短乳桿菌SLB1000 可提高SD大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性，并能降低機體中MDA含量，提高SD大鼠機體的抗氧化能力。

大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平指標(biāo)如表3 所示，與模型組（M）相比，短乳桿菌SLB1000 可提高SD 大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT 活性，且與菌液劑量呈正相關(guān)。短乳桿菌的高劑量組（EH）可降低肝臟中MDA含量，且效果優(yōu)于二甲雙胍陽性對照組（P），而低劑量短乳桿菌SLB1000 對肝臟中MDA 含量無降低作用。模型組（M）肝臟內(nèi)T-AOC 水平為87.55μmol/g，而短乳桿菌SLB1000 低劑量組（EL）和短乳桿菌SLB1000 高劑量組（EH）分別為149.43 μmol/g 和170.57 μmol/g，分別為模型組（M）的1.77 倍和1.95倍，推斷短乳桿菌SLB1000 可提高SD 大鼠肝臟的抗氧化能力。

表3 短乳桿菌SLB1000對SD大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平的影響Table 3 Effect of L.brevis SLB1000 on liver oxidative stress levels of SD rats

3 結(jié)論

本試驗篩選所得的短乳桿菌SLB1000 有一定的降糖效果，并能改善Ⅱ型糖尿病引起的機體器官損傷。在SD 大鼠體內(nèi)，不同劑量組之間表現(xiàn)的效果存在差異，如臟器指數(shù)及SOD、GSH-Px、CAT活性，存在劑量依賴關(guān)系，高劑量短乳桿菌SLB1000可清除更多的自由基，從而使肝腎指數(shù)趨于正常。在連續(xù)灌胃40 d后可以明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖值，并能提高血糖耐受性。攝入短乳桿菌SLB1000 還能顯著提高血清及肝臟中的SOD、GSH-Px 和CAT 酶類的活性，并降低MDA含量，同時提高肝臟中T-AOC水平。此外，菌株SLB1000還可以有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟和腎臟的臟器指數(shù)，緩解肌體內(nèi)臟器肥大的現(xiàn)象。由此可見，短乳桿菌SLB1000不僅對Ⅱ型糖尿病SD大鼠具有調(diào)節(jié)血糖的功效，緩解糖尿病癥狀，而且可以誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)血清和肝臟的抗氧化反應(yīng)，對由糖尿病引起的腎臟和肝臟的病變程度也有一定的保護作用。