致大米黃變優勢菌株的分離鑒定及其對大米氨基酸含量的影響

陳曉璐, 馮 儒, 王俊仁, 雷 瑤, 仝文君, 張玉申, 都立輝

(南京財經大學食品科學與工程學院1,南京 210000) (江蘇省農墾米業集團有限公司2,南京 210000) (江蘇省農墾農業發展股份有限公司現代農業研究院3,南京 210000)

小麥、稻谷、玉米被稱為世界三大主要糧食作物[1],其中稻谷是我國第一大糧食作物,其產量與播種面積位居世界第一,供應著65%以上人口的口糧[2]。稻谷采收后經過晾曬、礱谷脫殼、碾米得到精制白米,由于大米儲藏時間較長,期間大米會發生黃變,黃變會嚴重影響大米的外觀、品質和消費量。不僅如此,食用部分被真菌感染的黃變大米會引起食用者健康問題[3]。因此,人們對于黃變大米的關注度大大提高。

引起大米黃變的原因錯綜復雜,目前有關黃變大米的研究主要集中在黃變大米與正常大米的理化性質差異和品質變化等方面。對于大米黃變發生的條件因素和機理鮮有報道,其中有關微生物對大米黃變影響的研究更是少之又少。自然環境條件能夠誘導大米黃變,其中溫度和濕度水平被認為是引起大米黃變的主要原因,并且濕度條件更容易引起大米黃變,此外儲藏空間中的O2和CO2濃度和比例也對大米黃變產生影響[4]。微生物的存在對大米黃變有著微妙的作用,真菌感染能夠在一定程度上引起水稻黃變[5],Schroeder等[6]的研究中也指出了真菌侵染與大米黃變之間的關系。收獲期間部分田間真菌能夠使種子變色,籽?？菸?導致胚珠死亡,此外田間真菌還會引起加熱,使得稻谷品質急劇下降[7]。微生物發育是水稻儲藏期間重要的生命活動之一,當堆放的稻谷晾曬不完全時,上層水稻含有較高的水分含量使得微生物活性增強,進而導致水稻干物質的損失同時對水稻黃變產生一定的影響。此外,真菌代謝物能夠致使單個水稻籽粒發生黃變,同時非酶褐變也會作用于大米黃變進程[8]。非酶褐變反應包括焦糖化反應、美拉德反應、抗壞血酸氧化分解和多元酚氧化4種類型[9],其中美拉德反應被認為是導致大米黃變的機制之一,反應過程中能夠產生5-羥甲基糠醛(5-HMF)等一系列由黃到棕的呈色產物[10],而氨基酸作為美拉德反應的底物之一,其含量與比例對美拉德反應進程有很大的影響。在谷氨酸反應的過程中5-HMF的含量最高,而半胱氨酸和甘氨酸參與的反應中5-HMF含量低[10]。此外L-半胱氨酸的巰基與還原糖的羰基有可能發生親核加成反應,進而抑制蛋白質或其他氨基酸與糖類發生美拉德反應[11],阻止黃色物質的產生。已有研究表明真菌侵染在一定條件下可能會引起水稻黃變,并且真菌代謝產生的能量也為美拉德反應提供了一定的能量基礎,加速大米黃變進程,但真菌侵染與大米黃變間的直接關系鮮見報道。

本研究通過分離自然黃變大米上的菌株,并純化篩選找到致使大米黃變的優勢菌株,模擬真菌侵染大米黃變的過程,對引起大米黃變的優勢菌株進行鑒定,通過對比分析不同黃變程度的大米與正常大米之間氨基酸種類的差別,研究各種氨基酸在大米黃變中的變化與作用,為微生物侵染大米黃變機制的研究提供一個新的方向。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

實驗原始材料為市售大米;分析純(AR)試劑:氯化鈉、乙酸、鹽酸、丙三醇;優級純(GR)試劑:檸檬酸三鈉;純化及PCR相關試劑、T載體、感受態細胞、引物(ITS1/ITS4);馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar,PDA)。

1.2 儀器

L8800全自動氨基酸分析儀,TM3000臺式掃描電子顯微鏡,DYY-10C型電泳儀,CM-5色差儀,BIO-RAD全自動化學發光圖像分析系統,ZEISS正置熒光顯微鏡,HR21M冷凍高速離心機,96孔PCR擴增儀。

2 方法

2.1 優勢黃變菌株的分離

用適量無菌水浸泡洗脫大米上存在的菌株,將洗脫液涂步到PDA培養基上,于28 ℃恒溫培養箱中培養,培養4 d時分離并純化培養基上的菌落,將分離純化后的單菌落制成1×106CFU/mL新鮮孢子懸液,接種于無菌大米上,期間記錄真菌侵染大米黃變的情況,挑選出侵染效果佳、穩定性好的優勢菌株。保存于質量分數40%的甘油中,-20 ℃保藏。

2.2 形態學觀察

將優勢黃變菌株接種于PDA培養基上,觀察其生長速率與菌落形態,分別于第3、5、7天拍攝其菌落形態,并結合插片法[12]于掃描電子顯微鏡下觀察菌株的菌絲及孢子形態。

2.3 分子生物學方法

2.3.1 ITS基因片段的PCR擴增

ITS區域的擴增選擇真核生物通用擴增引物ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[13]。PCR的擴增條件為95 ℃預變性3 min,95 ℃變性30 s,50 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環,最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增采用的25 μL反應體系,刮取一定量新鮮菌絲體作為模板,加入2×mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O 10.5 μL,配制成25 μL的體系,進行PCR擴增。1.5%瓊脂糖凝膠在120 V 20 min條件下電泳檢測PCR擴增產物,于凝膠成像系統上拍照觀察[14]。

2.3.2 PCR擴增片段的純化與測定

利用DNA純化試劑盒純化PCR產物[15],并與T-Vector連接,然后轉化至感受態細胞中,并將其涂布于含有氨芐青霉素的LB培養基上,培養過夜(16 h);挑取平板上的白色單菌落,將其加入到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜;取2 μL菌液作為模板進行PCR擴增,PCR反應體系為25 μL,包括8.5 μL的ddH2O,12.5 μL的2×mix,1 μL的上游引物,1 μL的下游引物,引物為ITS通用引物,最后進行電泳檢測,尋找目的片段。

2.3.3 DNA序列測序和系統發育學分析

將純化后的ITS的單克隆PCR產物交由生物公司進行測序。獲得目的序列后,在NCBI中進行BLAST序列比對,建立系統發育樹,基于其共同的祖先原則,可以直觀地表達出物種之間的親緣關系和進化方向口[16],進而確定菌株的種屬類別,最后MEGA 11建樹分析。將優勢黃變菌株的鑒定序列上傳至NCBI數據庫中并獲得登錄號。

2.4 侵染與色度測量

2.4.1 侵染模擬

將分離純化出的優勢黃變菌株置于PDA培養基上培養4～5 d,用無菌水洗脫孢子并計數,將孢子液稀釋至1×106CFU/mL備用。在90 mm培養皿中稱取11.25 ～11.28 g的無菌大米,并向其中加入約大米質量18%的孢子洗脫液,輕輕震動至孢子液分布均勻。將其置于28 ℃的條件下培養,培養期間觀察記錄大米黃變情況。

2.4.2 色度測量

將模擬黃變3、7、12 d的樣品于通風櫥中連續干燥12 h以上,待完全干燥后,用旋風磨粉機19 000r/min磨粉,重復2次,過60目篩,用色差儀檢測記錄樣品的L*、a*、b*值,重復2次,試樣粉末保存備用。

2.5 氨基酸種類測定

參考GB 5009.124—2016[17]的方法并稍作修改,準確稱取一定量(使試樣蛋白含量在10～20 mg)均勻性好的試樣,加入6 mol/L的鹽酸在恒溫干燥箱中110 ℃水解24 h,后將水解液全部轉移到50 mL容量瓶并用去離子水定容,取1～2 mL水解液于旋轉蒸發儀完全蒸干,蒸干樣品用1～2 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解,過0.22 μm濾膜至進樣瓶中待測。

3 結果與分析

3.1 優勢黃變菌株分離結果

經過分批侵染實驗篩選出6株能夠致使大米發生色變的菌株,圖1b為優勢致黃變菌株,將其命名為B2。相較于其他5株致色變菌株,B2菌株侵染能力強,穩定性好,致黃變周期短且無其他有色成分干擾。此外,圖1g中為不能致使大米黃變的對照菌株將其命名為B4。

圖1 致大米色變菌株分離結果圖

3.2 菌株形態學鑒定

菌株形態學鑒定主要是觀察菌落的形態、顏色、生長狀態和生長速率,并利用光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌絲與孢子形態[18]。將B2、B4菌株于28 ℃培養,觀察其3、5、7 d的菌落形態及菌絲與孢子形態。

B2菌株生長能力強,3 d時已形成較大菌落,菌落整體為白色絮狀并呈放射狀生長。第3～5天,菌落生長速度較快約為3 d時菌落大小的3倍,菌落形態與3 d保持一致。生長至第7天時,菌落鋪滿整個培養基,整體上看菌落顏色分布均一,呈棉絮狀(圖2b1～圖2b3)。在顯微鏡下觀察,菌絲較光滑,有分支結構,有明顯的骨架菌絲和纏繞菌絲,無隔膜。孢子呈圓形,表面不光滑有小刺[19],菌落形態與硬毛粗蓋孔菌(Coriolopsistrogii)基本一致(圖3b1～圖3b2)。

B4菌株3 d時菌落較小,整體上看形成一個橄欖綠色菌落,絨狀質地,基本平鋪于培養基表面。第3～5天,菌落生長速度加快,呈橄欖綠色,最外圈有少量白色菌絲環繞,此階段由于孢子產生中央輕微凸起。生長至7 d時,菌落形態與大小與5 d時的菌落整體形態一致,菌落大小在1～2 cm(圖2a1～圖2a3)。在顯微鏡下觀察菌絲光滑,分生孢子梗直立或彎曲,有節狀膨大,具有分生孢子鏈,孢子呈現梭形、檸檬形、橢圓形,表面較光滑,0～1個隔膜[20],菌落形態與尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)基本一致(圖3a1～圖3a2)。

圖2 B4、B2菌落在PDA平板上生長第3、 5、7天的菌落形態

圖3 B4、B2菌絲、孢子形態

3.3 分子生物學分析

B2、B4菌株經過ITS擴增獲得全長為646 bp和551 bp的序列(圖4)。利用DNAMAN及BLAST對測序結果進行修飾對比。依據真菌分子分類鑒定原則,通過對ITS區域核苷酸序列進行比對,序列相似性大于99%的菌株為同種,序列相似性小于99%大于95%的為相同屬,序列相似性小于95%的鑒定為相同科[21]。根據ITS序列構建系統發育樹,B2菌與MW335162.1同處同一分支,為同一個種,表現出較近的親緣關系(圖5a)。B4菌株的ITS序列與Cladosporiumsp.的ITS序列同源性最高(圖5b)。將B2、B4的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對,其中B2菌株的ITS序列與Coriolopsistrogii的同源性最高,為100%。綜合菌落、孢子、菌絲形態可知,B2菌隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)傘菌綱 (Agaricomycetes) 多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)革孔菌屬(Coriolopsis)[22],也被命名為Trametestrogii[23]、Funaliatrogii[24]。B4菌株與Cladosporiumoxysporum的同源性最高,為99.69%。綜合菌落、菌絲、孢子形態可知,B4菌屬于半知菌亞門(Deuteromycota)絲孢綱(Hyphomycetes)叢梗孢目(Miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢屬(Cladosporium)尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)[25]。將B2菌株的序列上傳至NCBI的數據庫中,獲得NCBI登錄號為PRJNA896760。

圖4 B2、B4菌株的ITS基因片段擴增圖

3.4 侵染結果與色度分析

3.4.1 侵染結果

圖6分別為無菌水處理的對照組、B4、B2菌株侵染的試樣組生米黃變結果圖,結合圖7中蒸后大米的黃變結果圖,可以看出不同菌株的侵染效果之間存在明顯差異。對照組試樣在儲藏期間未發生明顯的顏色變化,相較之下,B2菌株表現出極強的侵染黃變作用,并且隨著儲藏時間的延長B2菌株侵染后黃變大米的比例和程度也達到更高水平。首先B2菌株的菌落為純白色,實驗期間基本不會影響對大米色變的觀察。其次儲存1 d時,大米表層基本無菌體覆蓋,大米顏色未發生顯著變化。B2菌生長能力強,生長速度快,3 d時大米表層均勻覆蓋一層白色菌體,整體上看各部分米粒顏色均勻一致,蒸熟后部分米粒發生黃變。3～5 d B2菌快速生長,大米粒表層被白色菌體緊緊覆蓋,相較于第3天的生長狀態,米粒表面的菌體更密集更厚實,對比蒸熟大米發現絕大部分米粒發生黃變。5～7 d大米顏色基本無變化,蒸前和蒸后差異很小,整體穩定。12 d時,蒸前大米表面菌體厚實均一,米粒呈現黃棕色,對比7 d的試樣12 d大米的黃變現象更明顯。B4菌株在儲藏過程中未能使大米發生黃變,但由于其菌落為橄欖綠色會在儲藏過程中降低大米亮度。

圖5 基于ITS序列構建B2(a)、B4(b)菌株的系統發育樹

注:a、b、c分別為對照組、B4、B2菌株侵染大米第1、3、5、7、12天生米結果圖圖6 生米結果圖

注:a、b、c分別為對照組、B4、B2菌株侵染大米第1、3、5、7、12天生米結果圖圖7 熟米結果圖

3.4.2 黃變米的色度分析

表1中記錄了各條件下大米的L*、a*、b*值,其中NR為未經任何處理的普通白米。L*值代表了樣品的明暗程度,數值在0～100之間,L*越大說明樣品亮度越高。顯然試樣的亮度均處于較高水平,相較于正常大米,各處理條件下的大米其亮度值均降低,但無菌水處理的對照組大米亮度值并無顯著性差異。a*值的大小代表了樣品的紅綠程度,數值在-80～100之間,a*>0表示偏紅,a*<0表示偏綠。所有試樣的a*均大于零,整體偏紅,并且導致黃變的菌株,其對大米a*值的影響是隨著黃變程度的加深而升高的,表現出更高的a*值,整體更紅。b*值代表了樣品黃藍程度的變化,數值在-80～70之間,b*>0表示偏黃,b*<0表示偏藍。顯然所有試樣都是b*>0,整體偏黃,對照組組內試樣在培養期間b*值未發生明顯變化,而B2菌株侵染黃變的試樣b*值隨培養時間的延長而增大,與NR和CK組數值存在顯著差異,黃色明顯。

表1 NR、CK、B4、B2試樣不同天數時色度對比(NR為普通白米)

3.5 氨基酸含量變化

由優勢黃變菌株B2侵染的黃變大米試樣中丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸占總氨基酸的比例整體上呈下降趨勢(圖8c),而CK組和B4菌株侵染的試樣組中,這幾類氨基酸所占比例未發生明顯降低,甚至B4組中丙氨酸、纈氨酸、精氨酸所占比例有所上升(圖8a、圖8b)。由B2菌株侵染的黃變試樣中,丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸隨著儲藏時間延長、黃變程度加深,其占比持續降低,并且與對照組(NR)試樣存在顯著性差異,有可能參與到大米黃變過程,作為美拉德反應的底物參與合成進而產生呈色物質[26],導致大米黃變。美拉德反應的本質就是氨基酸、蛋白質與還原糖之間復雜的反應[27],并且美拉德反應過程中會產生5-HMF、類黑精等一系列由黃到棕的呈色產物,其中5-HMF是最主要的呈色物質之一,其生成量受到氨基酸種類的影響,在谷氨酸反應的過程中5-HMF的含量最高,而半胱氨酸和甘氨酸參與的反應中5-HMF含量低[10]。Troise等[28]的研究中發現Arg的胍基和Lys的ε-氨基側鏈能與附著在蛋白質親和側鏈上的羰基結合發生美拉德反應。在任芳等[29]的研究中指出,優質稻谷在黃變過程中隨著黃變程度的加深,谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸含量隨黃度指數的增大一直呈現下降的趨勢,可能是大米黃變過程中起主要作用的氨基酸。Liu等[30]運用非靶向GC-TOF-MS的方法對黃變大米與正常大米的差異產物進行分析,指出氨基酸是大米黃變過程中變化最顯著的代謝物,碳水化合物、有機酸、脂肪酸和脂質緊隨其后。Liu等[30]還通過靶向LC-ESI-MS/MS的方法對黃變大米與正常大米進行差異分析,發現黃酮類化合物的代謝增強[31]。黃酮類等抗氧化代謝物的合成與苯丙素代謝途徑密切相關[32],而苯丙氨酸和酪氨酸是參與苯丙素代謝途徑的主要氨基酸,因此在大米黃變的進程中苯丙氨酸和酪氨酸含量會發生變化。

注:小寫字母不同代表數值之間差異顯著(P<0.05)。圖8 試樣在儲藏周期內部分氨基酸占總氨基酸的質量分數

4 結論

大米黃變是錯綜復雜的綜合反應,研究證明大米黃變過程中微生物的存在能夠對大米黃變產生一定影響,其中硬毛粗蓋孔菌(Coriolopsistrogii)是能夠穩定且有效引起大米黃變的菌株之一。

通過分析黃變大米與未黃變大米中各類氨基酸含量的變化發現,黃變大米中丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸占總氨基酸的比例隨著黃變程度加深而逐漸降低,暗示這些氨基酸可能參與了大米的黃變過程。氨基酸作為美拉德反應的底物之一,能夠通過羰氨縮合產生有色物質,而美拉德反應中的5-HMF等呈色產物可能是導致大米黃變的成分。鑒于目前鮮見這方面的研究,分離鑒定美拉德反應中能引起大米黃變的呈色物質將是后續的研究方向。